Smad2/3在斑马鱼胚胎早期发育中的作用

论文摘要

脊椎动物胚胎发育是当今生命科学研究的热点之一。胚胎的早期发育是一个非常复杂的过程,TGF-β、Fgf、Wnt等众多信号通路相互协调、共同参与调控。其中TGF-β/Nodal信号通路的下游效应因子Smad2/3在斑马鱼胚胎发育中的作用是本论文的研究重点。在斑马鱼中至少存在smad2、smad3a、smad3b三个基因,它们之间不但存在冗余的功能,而且均存在母体来源的转录本,因此很难直接用吗啉环标记的反义寡核苷酸的方法研究其功能。本研究分别构建了Smad2/3各自的显性抑制形式dnsmad2/3,为研究内源smad2/3的功能提供了重要的工具。TGF-β超家族中的Nodal、Activin和Vg1可以促进中内胚层的诱导,但其下游效应因子Smad2/3在斑马鱼胚胎中内胚层诱导过程中的作用迄今还没有明确的结论。本研究表明,Smad2/3对于斑马鱼中内胚层的诱导是必不可少的,缺少Smad2/3活性的细胞的中胚层命运会发生改变,而更加倾向于形成神经外胚层的命运。此外,在MZoep突变体胚胎中的研究表明,Smad2/3可能还介导了其它非Nodal信号的中胚层诱导作用。Wnt、Fgf、BMP、RA（视黄酸）等信号可以促进斑马鱼的神经诱导作用和神经外胚层的后部化。本研究发现,增强Smad2/3的活性可以促进神经诱导以及神经外胚层的后部化,抑制Smad2/3的活性可以抑制神经诱导过程。此外,抑制Smad2/3的活性不仅可以减轻增强Nodal信号所导致的神经外胚层后部化,而且还可以抵消增强Fgf或Wnt信号所导致的神经外胚层过度后部化的效果。在MZoep突变体胚胎中的研究表明,Smad2/3可能还介导了其它非Nodal信号在神经外胚层诱导及前后分化中的作用。鉴于Smad2/3在斑马鱼早期的胚胎发育过程中的重要作用,本研究还通过酵母双杂交的方法分别以Smad2、Smad3a、Smad3b为诱饵蛋白,筛选到了一些与之结合的母源因子。希望通过对这些母源因子的研究,能够为更加深入地理解Smad2/3在发育中的具体功能及其作用机制找到一些新的线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 以斑马鱼为代表的脊椎动物发育过程
• 1.1.1 斑马鱼的发育过程简介
• 1.1.2 斑马鱼作为模式动物的优点
• 1.2 胚胎发育过程中几条重要的信号通路概述
• 1.2.1 TGF-β信号通路
• 1.2.2 Nodal 信号通路
• 1.2.3 Wnt 信号通路
• 1.2.4 FGF 信号通路
• 1.3 脊椎动物中胚层和内胚层的诱导及背腹分化
• 1.3.1 中胚层和内胚层诱导及背腹分化过程
• 1.3.2 几条信号通路在中内胚层诱导及背腹分化中的作用
• 1.4 脊椎动物神经诱导及神经外胚层的分化
• 1.4.1 神经诱导的发生
• 1.4.2 神经外胚层前后轴线的建立和分化
• 1.5 本课题的研究意义和内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 斑马鱼胚胎的获得和培养
• 2.2 基因全长的获得及各种质粒的构建
• 2.3 反义寡核苷酸的设计及使用
• 2.4 mRNA 的制备与显微注射
• 2.4.1 mRNA 的制备
• 2.4.2 显微注射
• 2.5 探针的制备和斑马鱼整胚原位杂交
• 2.5.1 探针的制备
• 2.5.2 斑马鱼整胚原位杂交
• 2.6 Hep3B 细胞的培养与荧光素酶报告实验
• 2.6.1 细胞培养
• 2.6.2 PEI 转染法
• 2.7 细胞移植实验
• 第3章 Smad2/3 在斑马鱼中内胚层诱导中的作用
• 3.1 用MO 抑制smad2/3 表达不引起明显发育缺陷
• 3.1.1 smad2/3 的MO 可有效地抑制相应基因的表达
• 3.1.2 smad2/3 的MO 不会引起明显的胚胎发育缺陷
• 3.2 构建斑马鱼smad2/3 的显性抑制形式
• 3.2.1 设计构建斑马鱼smad2/3 的显性抑制形式
• 3.2.2 dnsmad2/3 的有效性及特异性验证
• 3.3 Smad2/3 是Nodal 信号诱导中内胚层发生的必要条件
• 3.4 抑制野生型胚胎中Smad2/3 的活性导致缺失中内胚层组织
• 3.5 抑制细胞中Smad2/3 的活性导致其中胚层命运改变为神经命运
• 3.6 Zoep 和Moep 突变体中进一步抑制Smad2/3 会引起更多中胚层的缺失
• 3.7 Smad2/3 可能通过介导其它非Nodal 信号的中胚层诱导作用
• 3.8 本章小结
• 第4章 Smad2/3 在神经诱导和神经外胚层前后轴线分化中的作用
• 4.1 Smad3 促进神经诱导和神经外胚层后部化
• 4.1.1 野生型胚胎中增强Smad3 活性可促进神经诱导和神经外胚层后部化
• 4.1.2 抑制野生型胚胎中Smad2/3 的活性可抑制神经诱导
• 4.2 在神经诱导和神经外胚层后部化中Smad2/3 与Nodal 信号的互作关系
• 4.2.1 sqt 过量表达促进神经诱导及神经外胚层的后部化
• 4.2.2 抑制Smad2/3 的活性可减轻sqt 过量表达导致的神经外胚层后部化
• 4.2.3 缺失Nodal 信号抑制神经诱导并导致神经外胚层前部化
• 4.2.4 MZoep 变体中的Smad2/3 活性对神经诱导和分化的影响
• 4.3 抑制Smad2/3 可抵消增强Fgf 信号所引起的神经外胚层过度后部化
• 4.4 抑制Smad2/3 可抵消增强Wnt 信号所引起的神经外胚层过度后部化
• 4.5 本章小结
• 第5章 Smad2/3 互作因子的筛选
• 5.1 利用酵母双杂交法鉴定与 Smad2/3 结合的母源因子
• 5.1.1 构建诱饵表达载体
• 5.1.2 构建斑马鱼母源 cDNA 文库
• 5.1.3 筛选与Smad2/3 互作的母源因子
• 5.2 Ppp4c 的初步功能分析
• 5.2.1 PPP4c 与Smads 蛋白的结合及其对TGF-β和BMP 信号的影响
• 5.2.2 ppp4ca 和ppp4cb 在斑马鱼胚胎中的表达谱分析
• 5.2.3 ppp4ca 或ppp4cb 在斑马鱼胚胎早期发育过程中的作用
• 5.2.4 缺失Ppp4cb 活性的细胞不能获得中胚层发育命运
• 5.3 小结和讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果