TGF-β1基因修饰的脂肪间充质干细胞复合PLGA构建组织工程化软骨的实验研究

论文摘要

第一章真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1质粒的构建和转染目的探讨真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1质粒的构建方法,并初步研究其转染脂肪间充质干细胞的可行性。方法利用基因重组技术,将大鼠TGF-β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、HindⅢ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-TGF-β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染ADSCs,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-GFP观察转染效率,采用RT-PCR和Western-blot检测被转染的ADSCs中TGF-β1的表达情况。结果重组质粒经XboⅠ、HindⅢ双酶切后出现1.35bp和5.4kb两条带,测序结果显示重组质粒所包含的TGF-β1全长碱基序列完全正确,GFP显示其转染脂肪干细胞的转染效率＞80%,且转染细胞后有TGF-β1mRNA和蛋白的表达上调。结论利用基因重组技术可成功构建能转染ADSCs的真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1质粒。第二章TGF-β1基因转染的脂肪间充质干细胞体外成软骨的研究目的探讨TGF-β1基因对ADSCs体外定向成软骨分化能力的作用。方法分离、培养大鼠ADSCs,pcDNA3.1-TGF-β1转染其第四代细胞后置于含10%新生牛血清、6.25μg/mL胰岛素、6.25μg/mL转铁蛋白、10-7M地塞米松、50μg/mL维生素C的高糖DMEM培养基中诱导、培养。同时将pcDNA3.1转染的ADSCs和单纯ADSCs设为对照组;在倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化;14天后应用甲苯胺兰染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色、aggrecan细胞免疫荧光评价细胞的成软骨能力;0周、2周和4周采用RT-PCR检测细胞Col2a1、Sox9和TGF-β1mRNA的表达情况,并用Western-blot检测Col2a1及Agc1蛋白的表达情况。结果TGF-β1转染组的ADSCs在初期时生长较对照组慢,24～48小时后生长迅速,细胞形态由梭形转变为三角形或多边形,14天后细胞爬片经甲苯胺兰染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色呈阳性,经aggrecan细胞免疫荧光检测见细胞的胞浆、胞膜均有绿色荧光表达,而对照组则仅维持贴壁生长,其标本在14天后经甲苯胺兰染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色和aggrecan细胞免疫荧光检测,其结果均为阴性;同时RT-PCR检测发现0周,2周,4周时转染组标本中Col2a1、TGF-β1和Sox9 mRNA的表达水平逐渐上调,而对照组中Col2a1、TGF-β1和Sox9 mRNA的表达低,转染组和对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.05）;Western-blot结果显示转染组中Col2a1和Agc1的蛋白表达水平在0周,2周,4周时也逐渐上调,转染组和对照组之间的差异也有统计学意义（P＜0.05）。结论真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1转染ADSCs后可获得TGF-β1的高效表达,并可促进体外培养的ADSCs定向分化为软骨细胞。第三章TGF-β1基因转染的脂肪间充质干细胞复合PLGA体内成软骨的研究目的探讨TGF-β1基因表达的ADSCs复合PLGA支架材料在体内构建组织工程化软骨的可行性。方法在体外将真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1修饰的ADSCs与PLGA支架材料复合,培养24h后将该复合物种植在裸鼠皮下,从形态学上初步评价构建组织工程化软骨的程度;4周时从裸鼠皮下提取标本行扫描电镜观察;于12周时取出移植物标本行组织学染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色;同时,用RT-PCR检测4周、8周和12周时标本中Col2al、Sox9和TGF-β1mRNA的表达情况。结果细胞/材料复合体植入裸鼠皮下后,裸鼠生长良好,伤口一期愈合;包块基本保持植入时的形态,但包块质地有所增韧,而对照组形成的包块则逐步缩小、松软,直至消失;扫描电镜观察见4周时实验组和对照组均有细胞在材料表面附着生长,但实验组细胞生长更旺盛,形成的基质也最为明显;12周时移植物标本经H-E染色、甲苯胺兰染色、藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色,结果均呈阳性;RT-PCR检测显示4周、8周和12周时实验组中Col2al和Sox9 mRNA表达逐渐上调,而TGF-β1mRNA在8周时的表达水平较4周及12周时高,各时间点检测到的Col2al、Sox9和TGF-β1mRNA的表达无显著差异（P＞0.05）。结论TGF-β1基因转染的ADSCs与PLGA支架材料复合后,可在体内构建异位软骨样组织,同时可使该软骨样组织长时间保持其软骨特异性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词简表
• 论文正文
• 前言
• 1真核表达载体质粒的构建和转染'>第一章 pcDNA3.1-TGF-β₁真核表达载体质粒的构建和转染
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 1基因转染的脂肪间充质干细胞体外成软骨的研究'>第二章 TGF-β₁基因转染的脂肪间充质干细胞体外成软骨的研究
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 1基因转染的脂肪间充质干细胞复合PLGA体内成软骨的研究'>第三章 TGF-β₁基因转染的脂肪间充质干细胞复合PLGA体内成软骨的研究
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间论文著作成果