纤维蛋白胶人羊膜上皮细胞片及其重建角膜上皮的研究

论文摘要

目的:(1)研究人羊膜上皮细胞(HAECs)体外培养的生物学特性,探讨HAECs体外培养的方法,为组织工程角膜上皮的构建奠定基础;(2)观察HAECs在体外构建的纤维蛋白胶(FG)膜表面的生长状态,研究FG和抑肽酶对HAECs增殖的影响,探讨以FG制备组织工程HAECs片的可行性;(3)探讨利用FG组织工程HAECs片重建角膜上皮的可行性。方法:(1)采用酶消化法分离培养HAECs,观察细胞贴壁生长情况,并对生长良好的原代细胞进行消化传代,用倒置显微镜、HE染色、免疫组化染色对细胞进行形态学观察和鉴定;(2) MTT法测定抑肽酶对HAECs增殖的影响;并比较接种在胶体表面的HAECs与接种于未包被胶体的培养板上的HAECs的克隆形成率;用倒置显微镜,HE染色和扫描电子显微镜观察细胞在FG表面的生长情况;(3)采用环形板层切除法制备单眼兔角膜缘干细胞缺乏模型,2月后利用细胞片移植术重建角膜上皮。每日观察植片的存活状况及眼表的稳定性,术后1月取兔角膜组织进行组织学切片,CK12免疫组化染色,明确上皮来源。结果:(1)在体外培养条件下,HAECs能贴壁生长,细胞呈典型的上皮细胞样外观,可传6—8代。(2)抑肽酶浓度大于4×10~5KIU/L时对HAECs生长有显著抑制作用。制备的FG片光滑、透明,随培养细胞的生长而部分降解,可获得带有部分FG的HAECs片;接种在FG表面的HAEC与接种在培养板表面的相比,其克隆形成率无明显差别;HAECs在胶体表面生长良好,细胞有复层生长趋势,植片较透明。(3) 7只兔眼造模成功,出现角膜缘干细胞缺乏的表现。移植术后,3只兔植片存活情况良好,荧光素钠染色浅点片状着色,角膜透明度较术前有不同程度提高,移植片下方见新生血管增殖,局限于角膜周边;2只术眼植片未降解,形成角膜白斑;1只兔术后三天拆除眼睑缝线,植片脱落,移植失败。术后1月角膜HE染色角膜样上皮细胞排列紧密,CK12弱阳性表达,眼表结构基本稳定。结论:(1)HAECs可在体外成功分离,获得的细胞能进行长期培养。(2)利用FG为载体,可在体外成功构建纤维蛋白胶组织工程人羊膜上皮细胞片。(3)纤维蛋白胶组织工程人羊膜上皮细胞片有望用成为组织工程角膜上皮重建的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 1. 组织工程角膜上皮重建的研究现状
• 2. 羊膜上皮细胞的研究现状及应用前景
• 3. 纤维蛋白胶的生物学特性
• 4. 纤维蛋白胶在组织工程角膜重建中的应用
• 5. 本研究目的和意义
• 第一部分 人羊膜上皮细胞的体外培养
• 材料与方法
• 1. 主要材料与仪器
• 2. 主要方法
• 结果
• 1.倒置显微镜
• 2.HE染色结果
• 3、免疫组化染色结果
• 讨论
• 第二部分 纤维蛋白胶组织工程人羊膜上皮细胞片的构建
• 材料与方法
• 1. 主要材料与仪器
• 2. 主要方法
• 结果
• 1.MTT比色法检测结果
• 2.胶体对人羊膜上皮细胞克隆形成率的影响
• 3.倒置显微镜观察
• 4.石蜡切片HE染色
• 5.扫描电子显微镜观察
• 讨论
• 第三部分 人羊膜上皮细胞片重建角膜上皮的实验研究
• 材料与方法
• 1. 主要材料与仪器
• 2. 主要方法
• 结果
• 1.兔角膜缘干细胞缺乏模型
• 2.移植后纤维蛋白胶组织工程人羊膜上皮细胞片的存活情况
• 3.移植后纤维蛋白胶组织工程人羊膜上皮细胞片的组织学观察
• 4.移植眼角膜组织角蛋白多克隆抗体CK12免疫组化检侧
• 讨论
• 结论
• 问题与展望
• 参考文献
• 主要英文缩略词
• 附图及说明
• 在读期间发表的文章
• 致谢