高、低转移潜能乳腺癌细胞的差异表达蛋白研究

论文摘要

目的：探讨利用细胞穿透人工基质膜能力的差异筛选高、低转移潜能乳腺癌细胞的可行性，并分析二者生物学特性差异。方法：利用人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s细胞在Transwell小室上连续穿透人工基质膜获得高、低转移潜能细胞株。透射电镜观察所筛选出的不同转移潜能乳腺癌细胞的超微结构差异，MTT法进行细胞生长曲线、倍增时间及粘附率实验，Transwell小室进行细胞侵袭力、血管形成实验。用免疫组化方法测定两株细胞中基质金属蛋白酶2、9和上皮性钙粘素的表达情况。结果：MDA-MB-435s细胞经过在Transwell小室上连续人工基质膜侵袭实验后，获得两株转移潜能不同的乳腺癌细胞株，它们具有差异明显的体外生长速度、侵袭力、粘附力以及诱导人脐静脉血管内皮细胞形成血管的能力。⑴细胞透射电镜形态学观察示：高转移潜能乳腺癌细胞电镜观察显示大部分细胞呈梭形或圆形，细胞核大、常染色质丰富，异染色质少，核仁发达、甚至多个，部分细胞可见核仁靠边，可见核畸形，少数细胞可见核分裂相。胞浆少，细胞器少，有少量的线粒体和大量的游离核糖体，细胞表面可见微绒毛。与高转移潜能乳腺癌细胞超微结构相比较，低转移潜能乳腺癌细胞异染色质稍多，核仁稍少，核分裂相稍少，胞浆中线粒体稍多，游离核糖体稍少。⑵生长曲线、倍增时间实验示：高转移潜能细胞体外生长速度显著快于低转移潜能细胞；细胞倍增时间高转移潜能细胞为34.166±1.405小时，低转移潜能细胞为39.797±2.018（P＜0.05），两者有显著性差异。⑶侵袭实验示：高、低转移潜能细胞穿膜数量分别为61.46±7.08个/视野，25.32±4.87个/视野（P＜0.05）。高转移潜能细胞的侵袭能力显著强于低转移潜能细胞，差异有显著性。⑷细胞粘附实验示：高转移潜能细胞在30min、60min、90min和120min时其粘附率分别为0.1696±0.0034、0.2779±0.0070、0.3913±0.0109和0.5750±0.0202，均强于低转移潜能细胞的0.1109±0.0068、0.1813±0.0144、0.2961±0.0375和0.4134±0.0996（P＜0.05），差异有显著性。⑸血管形成实验示：高转移潜能细胞诱导人脐静脉血管内皮细胞形成血管管腔数为12.44±1.32个/视野，显著高于低转移潜能细胞所致的5.41±0.82个/视野（P＜0.01）；高转移潜能细胞诱导的血管形成的管腔长度为243.54±44.31μm，明显长于低转移潜能乳腺癌细胞的117.47±19.78μm（P＜0.05）。⑹免疫组化实验示：图像分析结果低转移潜能细胞中基质金属蛋白酶-2和-9的平均光密度值分别为0.16±0.02和0.13±0.03；高转移潜能细胞中分别为0.24±0.04和0.23±0.05（P＜0.05）。基质金属蛋白酶-2和-9在高转移潜能细胞组表达水平高于低转移潜能细胞组。低转移潜能细胞中上皮性钙粘素的平均光密度值为0.16±0.04；高转移潜能细胞中为0.11±0.01（P＜0.05）。上皮性钙粘素在高转移潜能细胞组的表达水平低于低转移潜能细胞组，均存在显著性差异。结论：利用细胞穿透人工基底膜能力的差异能够筛选出高、低转移潜能的乳腺癌细胞。来自同一亲本的高、低转移潜能细胞之间的生物学特性差异有显著性。目的：肿瘤转移相关蛋白在肿瘤细胞转移过程中具有重要作用，本研究拟在建立高、低转移潜能乳腺癌细胞株MDA-MB-435s的基础上，筛选乳腺癌转移相关蛋白。方法：应用双向凝胶电泳分别分离高、低转移潜能乳腺癌细胞的蛋白质，用银染法对电泳后的凝胶染色；ImageMaster2D V2002.1图像分析系统对胶图进行分析，寻找二倍以上的差异表达蛋白；然后取差异显著的蛋白质点进行酶解，应用基质辅助激光解吸附电离质谱进行分析；再将差异显著的蛋白质点质谱数据输入Mascot数据库查询。结果：在对所分离的两株细胞的蛋白质应用双向凝胶电泳技术和图像分析系统进行比较分析后，确认36个有差异表达的蛋白质斑点。其中，高转移潜能细胞株中有11个蛋白质点的相对含量高于低转移潜能细胞株；低转移潜能细胞株中有25个蛋白质点的相对含量高于高转移潜能细胞株。质谱分析结果示，在对20个差异显著的蛋白质点分别做基质辅助激光解吸附电离质谱后，成功鉴定了20个差异表达蛋白。对其中CDK6、STAT1、PGAM1、PLD5、RAB7B、GSDM1、BRCA1等差异表达蛋白的生物学意义进行了详细的讨论和评估。结论：由乳腺癌MDA-MB-435s细胞所分离高、低转移潜能细胞中存在有显著差异表达的蛋白质。目的：对双向电泳所分离的差异显著的蛋白质斑点，经质谱分析获得的部分候选蛋白质作鉴定。方法：利用RT-PCR法检测3个候选蛋白质ANX A1、HSP70和MYLK2在高、低转移潜能细胞中mRNA的表达水平，应用Western-blot法检测3个候选蛋白质ANX A1、HSP70和MYLK2的蛋白表达情况。结果：3个候选蛋白质ANX A1、HSP70和MYLK2在乳腺癌MDA-MB-435s细胞所分离高、低转移潜能细胞中的mRNA和蛋白质表达水平变化显著，且有统计学意义的差异。其中，⑴高转移潜能细胞株中Annexin A1蛋白质表达水平低于低转移潜能细胞株，其平均光密度值分别为0.13±0.02和0.42±0.06（P＜0.05）；高转移潜能细胞株中Annexin A1mRNA表达水平低于低转移潜能细胞株,其平均光密度值分别为0.12±0.03和0.31±0.06（P＜0.05）。⑵高转移潜能细胞株中HSP70蛋白质表达水平高于低转移潜能细胞株，其平均光密度值分别为0.62±0.10和0.21±0.04（P＜0.05）；高转移潜能细胞株中HSP70mRNA表达水平高于低转移潜能细胞株，其平均光密度值分别为0.47±0.06和0.27±0.03（P＜0.05）。⑶高转移潜能细胞株中MYLK2蛋白质表达水平高于低转移潜能细胞株，其平均光密度值分别为0.54±0.08和0.18±0.03（P＜0.05）；高转移潜能细胞株中MYLK2mRNA表达水平也高于低转移潜能细胞株，其平均光密度值分别为0.49±0.07和0.25±0.04（P＜0.05）。结论：乳腺癌MDA-MB-435s细胞所分离高、低转移潜能细胞中存在与乳腺癌转移相关的蛋白质。ANXA1、HSP70以及MYLK2与乳腺癌转移相关，其蛋白表达水平与mRNA转录有关。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系的建立与生物学特性的分析
• 前言
• 实验一 高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验二 高、低转移潜能乳腺癌形态学比较及细胞生长曲线、倍增时间测定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 透射电镜结果
• 3.2 细胞生长曲线实验
• 3.3 细胞倍增时间测定
• 实验三 高、低转移潜能乳腺癌细胞侵袭、粘附率实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验四 血管形成实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验五 基质金属蛋白酶及钙粘素在高低转移潜能乳腺癌细胞中的表达及意义
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 高低转移潜能乳腺癌细胞株的差异表达蛋白研究
• 前言
• 实验一 高、低转移潜能乳腺癌细胞株的蛋白质分离
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验二 高低转移潜能乳腺癌细胞株的蛋白质质谱分析和数据库查询
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 高低转移潜能乳腺癌细胞差异表达蛋白鉴定研究
• 前言
• 实验一 WESTERN-BLOT法检测 ANNEXINA1、HSP70 、MYLK2 在高低转移潜能细胞中的蛋白表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验二 RT-PCR 法检测 ANNEXINA1、HSP70 、MYLK2 在高低转移潜能细胞中 MRNA 表达量变化
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 全文总结
• 文献综述一
• 参考文献
• 文献综述二
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文