筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经及雪旺细胞DNA氧化损伤致细胞凋亡的影响

论文摘要

[目的]从整体、细胞及分子水平,研究中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经DNA氧化损伤致细胞凋亡的作用,以及筋脉通含药血清对由于高糖培养雪旺细胞DNA氧化损伤致细胞凋亡的影响。[方法]1.整体实验建立糖尿病大鼠模型,随机分为模型对照组、筋脉通小剂量、中剂量、大剂量组及维生素C组,每组14只。以体重、鼠龄及性别相匹配的正常大鼠10只作为正常对照组。筋脉通小、中、大组分别按成人剂量5倍、10倍和20倍给药；维生素C组按成人剂量10倍给药。模型组和正常组灌服蒸馏水。所有实验大鼠于灌胃16w处死。检测各组治疗前及治疗后4w、8w、12w和16w的体重和血糖变化,治疗后16w大鼠机械痛阈,并检测大鼠坐骨神经8-OHdG. PARP-1 （89kDa）及活化的Caspase-3（17kDa）的表达。2.细胞实验体外培养雪旺细胞,并通过S-100蛋白法进行鉴定。取第3代培养的雪旺细胞,加入含50mmolGlu DMEM培养基,用含筋脉通（JMT）和维生素C（VC）的鼠血清加入到上述含50mmolGluDMEM培养基中进行共同培养。干预48h后,采用激光扫描共聚焦显微技术检测活性氧荧光探针、活化的caspase-3（17kDa）的表达；采用ELISA法检测细胞上清液8-OHdG的分泌量；采用Western Blot的方法检测细胞PARP-1 （89kDa）的蛋白表达；采用实时荧光定量PCR法检测Caspase-3mRNA的表达。[结果]1.整体实验（1）血糖和体重的变化STZ-DM大鼠血糖与正常组相比均明显升高（P<0.01）。药物干预后,治疗组血糖在同一时间点与模型组相比无明显差异（P>0.05）,治疗组间血糖在各时间点均无明显差异（P>0.05）。干预前后,各组大鼠的体重在同一时间点无统计学差异（P>0.05）。（2）筋脉通对大鼠机械痛阈值的影响与正常组比较,模型组的机械痛阈值显著降低（P<0.01）；各治疗组的机械痛阈值均有不同程度降低,但与模型组比较,各治疗组阂值明显升高（P<0.01）：各治疗组之间比较,筋脉通中剂量组较其它各治疗组均有显著升高（P<0.01）。（3）筋脉通对坐骨神经8-OHdG表达的影响与正常组比较,模型组的积分光密度值增高,差异非常显著（P<0.01）；各治疗剂量组的积分光密度值均较正常组增高（P<0.01）,但较模型组降低（P<0.01）。筋脉通中剂量组积分光密度值明显低于其它各治疗组（P<0.01）,维生素C组与筋脉通大剂量组的结果无统计学差异（P>0.05）,均低于筋脉通小剂量组（P<0.05）。（4）筋脉通对坐骨神经PARP-1 （89kDa）表达的影响筋脉通大、中、小剂量组和维生素C组的蛋白谱密度值均较模型组显著降低（P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05）。各治疗组之间比较,筋脉通中剂量组的蛋白谱密度值明显低于其它各治疗组（P<0.01）；与维生素C组比较,筋脉通大剂量组的蛋白谱密度值降低（P<0.05）,筋脉通小剂量组的结果则与其无统计学差异（P>0.05）。（5）筋脉通对坐骨神经活化的caspase-3 （17kDa）蛋白表达的影响与正常组比较,模型组的积分光密度值显著增高（P<0.01）；筋脉通大、中、小组和维生素C组的积分光密度值较DM组降低（P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05）。各治疗组之间比较,筋脉通中剂量组明显低于其它各治疗组（P<0.01）,维生素C组和筋脉通大剂量组的结果无统计学差异（P>0.05）,但较筋脉通中剂量组和小剂量组增高且差异显著（P<0.01,P<0.05）。（6）筋脉通对坐骨神经caspase-3 （17kDa） mRNA表达的影响各治疗组和模型组caspase-3 mRNA表达增加明显（P<0.01）。各治疗组之间比较,筋脉通中剂量组caspase-3 mRNA表达明显低于其它各治疗组（P<0.01）,维生素C组和筋脉通大剂量组及小剂量组结果无统计学差异（P>0.05）,但与筋脉通中剂量组结果增高且差异显著（P<0.01）。（7）坐骨神经活化的Caspase-3蛋白及mRNA表达的相关性分析统计学直线相关分析发现,各组大鼠坐骨神经活化的Caspase-3蛋白和mRNA表达水平呈正相关（r=0.935,P<0.01）2.细胞实验（1）筋脉通含药血清对细胞内ROS水平的影响与正常组比较,50mmolGlu高糖组雪旺细胞以及治疗组筋脉通含药血清组和维生素C含药血清组的ROS-DCF荧光强度值均增高,差异非常显著（P<0.01）。与50mmolGlu高糖组相比,治疗组的ROS-DCF荧光强度值均显著降低（P<0.01）。治疗组间比较,筋脉通含药血清组ROS-DCF的荧光强度值低于维生素C含药血清组,但2组荧光强度值无统计学差异（P>0.05）。（2）筋脉通含药血清对细胞上清液8-OHdG含量的影响与正常组比较,50mmolGlu高糖组细胞上清液8-OHdG含量显著增高（P<0.01）。筋脉通含药血清组及维生素C含药血清组细胞上清液8-OHdG的含量均较正常组增高,差异非常显著（P<0.01）,但较50mmolGlu高糖组降低,差异非常显著（P<0.01）。治疗组间比较,筋脉通含药血清组细胞上清液8-OHdG的含量低于维生素C含药血清组,差异显著（P<0.05）（3）筋脉通含药血清对细胞内PARP-1 （89kDa）蛋白表达的影响与正常组比较,50mmolGlu高糖组、筋脉通含药血清组及维生素C含药血清组雪旺细胞内PARP-1 （89kDa）含量明显增加（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。与50mmolGlu高糖组比较,筋脉通含药血清组含量明显降低,差异非常显著（P<0.01）；维生素C组雪旺细胞内PARP-1 （89kDa）含量亦降低（P<0.05）。治疗组间比较,筋脉通含药血清组含量明显低于维生素C组,差异非常显著（P<0.01）（4）筋脉通含药血清对细胞内活化的Caspase-3 （17kDa）蛋白表达的影响与正常组比较,50mmolGlu高糖组、筋脉通含药血清组及维生素C含药血清组雪旺细胞中活化的Caspase-3的荧光强度值明显增高（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。与50mmolGlu高糖组相比,筋脉通含药血清组强度值降低,差异非常显著（P<0.01）,维生素C组强度值亦降低,但无统计学差异（P>0.05）。治疗组间比较,筋脉通含药血清组荧光强度值低于维生素C组,差异非常显著（P<0.01）。（5）筋脉通含药血清对细胞内活化的Caspase-3 （17kDa） mRNA表达的影响与正常组比较,高糖培养的各组雪旺细胞中活化的caspase-3 mRNA表达增加明显（P<0.01）。与50mmolGlu高糖组相比,筋脉通含药血清组mRNA表达明显降低（P<0.01）,而维生素C含药血清组亦降低但结果无统计学差异（P>0.05）。治疗组间比较,筋脉通含药血清组较维生素C组mRNA明显降低,差异显著（P<0.01）。[结论]1.整体实验（1）空腹单次腹腔注射STZ 60mg/kg后16周DPN模型成功建立,筋脉通可以提高大鼠机械痛阈值,改善DPN大鼠痛觉过敏。（2）筋脉通可减少DPN大鼠坐骨神经中8-OHdG的表达,可以减轻DPN大鼠周围神经组织因氧化应激导致的DNA氧化损伤。（3）筋脉通可减少DPN大鼠坐骨神经中PARP-1 （89kDa）的表达,抑制PARP-1酶解,在一定程度上防止DPN大鼠周围神经细胞因DNA损伤而导致细胞凋亡的启动。（4）筋脉通可下调DPN大鼠坐骨神经中活化的caspase3蛋白及mRNA的表达,减少DPN大鼠周围神经细胞凋亡。2.细胞实验（1）高糖培养环境下雪旺细胞ROS和8-OHdG表达增高,提示雪旺细胞内存在氧化应激反应并造成细胞DNA氧化损伤。（2）筋脉通含药血清能显著降低ROS和8-OHdG表达,证明筋脉通有一定抗氧化应激作用,并能够减轻细胞DNA氧化损伤。（3）筋脉通含药血清能的降低PARP-1的活性和酶解,减少细胞凋亡,可能是通过抑制DNA氧化损伤途径实现的。[创新点]从整体、细胞及分子水平,通过氧化应激-DNA氧化损伤-细胞凋亡途径,研究中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经的保护作用,以及筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞DNA氧化损伤致细胞凋亡途径的影响,经检索国内外文献未见中药复方相关报道。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分:筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经DNA氧化损伤致细胞凋亡的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 第二部分:筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞DNA氧化损伤致细胞凋亡的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 个人简历
• 致谢