光合细菌羰基还原酶不对称加氢催化体系的研究

论文摘要

随着人们对不对称合成手性化合物的深入研究,生物不对称加氢发展为现代研究的热点和焦点。生物催化一般选择微生物整体细胞为催化剂,因其具有反应条件温和、效率高、产物比较单一等优点,后来研究发现其反应体系中存在酶位点选择性低、底物浓度的限制等问题。目前,研究人员利用分离纯化的羰基还原酶还原潜手性化合物,不仅可以增加酶与底物的接触机会,提高光学纯度,而且可以进一步了解酶的作用机制,因此酶法还原再次掀起了国内外研究手性化合物的新浪潮。本课题一方面从光合细菌中分离纯化出羰基还原酶,并对其酶学性质进行研究；另一方面是建立羰基还原酶催化体系,并优化其催化条件,选择催化的最适底物,为研究酶催化机制和实现工业化生产奠定基础。其主要内容如下：1.通过超声破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析三步纯化分离得到一种较纯的依赖于辅酶NADPH的羰基还原酶。该酶的比活从0.9 U/mg提高到36 U/mg,纯化倍数为40。对其进行SDS-PAGE电泳分析,显示一条带,并测得其相对分子量约为37 kD。2.采用紫外测定酶活,对该酶的酶学性质进行研究。结果表明：酶的最适pH值为8,最适温度为37℃,在pH值为7-9之间比较稳定,但其热稳定性较低。该酶对苯乙酮的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.26 mmol/L和2.4μmol/（min mg）。3.构建了辅酶再生体系、羰基还原酶催化苯乙酮体系以及酶催化与辅酶再生偶联体系,并对催化体系进行优化。结果表明,该酶催化苯乙酮的最佳条件：底物浓度为2.5 mmol/L,反应温度为37℃,反应时间为24 h,此时苯乙酮的产率可达到49.3%、ee值为99%。4.采用气相色谱为检测手段,考察了酶对芳香酮类、脂肪酮类化合物的还原。结果显示该酶对电负性强的基团在苯乙酮α位取代的衍生物以及五碳脂肪酮的专一性较强；且具有极高的立体选择性,都在99%以上。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物不对称合成
• 1.1.1 手性化合物的意义及合成方法
• 1.1.2 生物催化羰基不对称加氢反应
• 1.1.3 生物催化剂
• 1.1.4 整体细胞催化和酶催化
• 1.2 羰基还原酶催化的研究进展
• 1.2.1 羰基还原酶分离纯化的研究
• 1.2.2 羰基还原酶的酶学特性的研究
• 1.2.3 影响羰基还原酶不对称还原的因素
• 1.2.4 羰基还原酶的底物特异性
• 1.3 本课题的研究目的与主要内容
• 第二章 光合细菌羰基还原酶的分离纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 酶的分离纯化
• 2.2.2 纯化结果
• 2.2.3 酶纯度检测结果
• 2.3 小结
• 第三章 光合细菌羰基还原酶酶学性质的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 辅酶依赖性
• 3.2.2 最适pH值
• 3.2.3 最适温度
• 3.2.4 酶的pH值稳定性
• 3.2.5 酶的热稳定性
• m值的测定'>3.2.6 K_m值的测定
• 3.3 小结
• 第四章 羰基还原酶催化苯乙酮体系构建及催化条件的优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.1.4 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 氢化酶再生辅酶NADPH
• 4.2.2 菌绿素再生辅酶NADPH
• 4.2.3 产物分析
• 4.2.4 酶催化苯乙酮的结果
• 4.2.5 底物浓度对催化合成的影响
• 4.2.6 反应温度对合成的影响
• 4.2.7 反应时间对催化合成的影响
• 4.3 小结
• 第五章 光合细菌羰基还原酶催化不同类羰基化合物的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.1.4 实验方法
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 芳香酮类化合物的还原
• 5.2.2 简单脂肪酮类化合物的还原
• 5.3 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式