无花果内生菌WHG1抗菌蛋白的分离纯化及发酵条件的优化

论文摘要

本文从无花果中分离出一株具有较高抑菌活性的枯草芽孢杆菌WHG1,对该菌进行鉴定并对其代谢的抗菌蛋白的性质进行了研究,对WHG1产抗菌蛋白的固态发酵和液态发酵进行了比较,确定了发酵培养基最佳配比和最佳发酵参数,最后初步探讨了WHG1抗菌蛋白对两种指示菌的抗菌机理。本研究对无花果内生菌资源的开发和利用起着抛砖引玉的作用,也为开发新型天然防腐剂提供了理论上的依据。1从无花果果实中分离了一株具有较强抑菌活性的内生枯草芽孢杆菌WHG1。根据形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析,确定WHG1为一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。通过对WHG1抑菌活性的研究发现,对大肠杆菌的抑菌直径为25mm,对沙门氏菌的抑菌直径为19mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为29mm,对黑曲霉的抑菌直径为13mm,对酵母的抑菌直径为30mm。2通过硫酸铵盐析,得到了WHG1抗菌蛋白粗提液,采用牛津杯法确定了硫酸铵最佳饱和度80%,粗提液经SephadexG100柱、DEAE-Sepharose Fast Flow柱纯化和聚乙二醇包埋浓缩后得到两种物质,茚三酮反应和双缩尿反应都呈阳性,推测为蛋白类物质。SDS-PAGE电泳分析表明已达到电泳纯度,分子量在25KD和53KD左右,抑菌圈直径能达30mm和26mm。高温能破坏抗菌蛋白的活性,pH的变化对其影响不大,紫外线对其的活性也基本没有影响,而抗菌蛋白对胰蛋白酶和胃蛋白酶比较敏感,对蛋白酶K、木瓜蛋白酶部分敏感,对α-淀粉酶不敏感。3探讨了固态发酵和液态发酵两种发酵方式对WHG1抗菌蛋白的制备比较。研究中可以发现各有优缺点,固态发酵的操作性比起液态发酵更为简便,但两者对大肠杆菌的抑制效果相差不大,抑菌圈直径都在25mm左右,并且固态发酵后对抗菌蛋白液的滤菌困难是固态发酵的一个致命缺点,导致分离抗菌蛋白的成本太高。最终确定液态发酵为本试验的发酵方法。4通过正交试验确定发酵培养基的最佳配比为：牛肉膏0.5%,玉米浆2%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%, Na2HPO4 0.15%, pH7.8。最佳发酵条件为：种龄14h,接种量3%,装液量50mL,在35℃,180r/min发酵24h,抑菌圈直径可达27.7mm。5 WHG1的抗菌粗提物作用于黑曲霉孢子悬液中,发现孢子内容物外泄,并逐渐自溶。对大肠埃希氏菌作用后,出现菌体生长异常,大小不一,营养不良的现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 植物内生菌
• 3 产抗菌物质植物内生菌的研究概况
• 3.1 植物内生菌抗菌的普遍性
• 3.2 植物内生菌抗菌的多样性
• 3.3 产抗菌物质植物内生真菌
• 3.4 产抗菌物质植物内生细菌
• 3.5 产抗菌物质植物内生放线菌
• 4 植物内生菌产生的抗菌物质—细菌素
• 4.1 细菌素的化学成分
• 4.2 细菌素的分类
• 4.3 细菌素与抗生素的区别
• 4.4 细菌素的合成
• 4.5 抗菌机制
• 5 细菌素在食品工业中的应用
• 5.1 肉类和海鲜制品
• 5.2 乳制品
• 5.3 蔬菜类制品
• 6 菌株WHGI的研究背景
• 第二章 无花果拮抗内生菌WHG1分离鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 无花果表面消毒和拮抗内生菌的分离筛选
• 2.2.2 拮抗菌抑菌活性研究
• 2.2.3 WHGI菌种鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 无花果内生拮抗菌的分离筛选
• 2.3.2 拮抗菌抑菌活性研究
• 2.3.3 拮抗内生菌菌种鉴定
• 3 小结
• 第三章 WHG1抗菌蛋白的分离纯化及性质研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白粗提物制备
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白的抑菌实验（以大肠埃希氏菌为试验指示菌）
• 2.2.3 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白的分离提取
• 2.2.4 纯度检测及分子量的测定
• 2.2.5 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白性质研究
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 最佳硫酸铵饱和度的确定
• 2.3.2 透析袋的选择
• 2.3.3 有机溶剂沉淀
• 2.3.4 SephadexG-100层析
• 2.3.5 DEAE-Sepharose Fast Flow层析
• 2.3.6 抗菌蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.7 抗菌蛋白性质研究
• 3 小结
• 第四章 抗菌蛋白液态发酵和固态发酵的比较试验
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 固态发酵和液态发酵操作性比较
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 固态发酵与液态发酵操作性的比较
• 3 小结
• 第五章 WHG1抗菌蛋白液态发酵条件的优化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 WHG1抗菌蛋白粗提物的制备
• 2.2.2 抗菌蛋白粗提物的抑菌实验
• 2.2.3 液态发酵培养基的优化
• 2.2.4 液态发酵条件的优化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 碳源对WHG1抗菌蛋白活性的影响
• 2.3.2 氮源对WHG1抗菌蛋白活性的影响
• 2.3.3 无机盐对WHG1抗菌蛋白活性的影响
• 2.3.4 初始pH对WHG1抗菌蛋白活性的影响
• 2.3.5 碳源、氮源和无机盐的正交优化
• 2.3.6 液态发酵条件的优化
• 3 小结
• 第六章 WHG1抗菌蛋白的抗菌机制初探
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 种菌
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白粗提物的制备
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白粗提物的抑菌试验（牛津杯法）
• 2.2.3 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白抑菌机理的研究
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白粗提物的抑菌试验
• 2.3.2 WHG1抗菌蛋白抗菌机理的研究
• 3 小结
• 第七章 结论
• 1 无花果拮抗内生菌WHG1分离鉴定
• 2 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白的分离纯化及其性质研究
• 3 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白液态、固态发酵对比的研究
• 4 枯草芽孢杆菌WHG1发酵培养基和发酵条件的优化
• 5 枯草芽孢杆菌WHG1抗菌蛋白抑菌机理的初步探究
• 6 展望
• 参考文献
• 致谢