论文题目: 基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 张梁
导师: 章克昌
关键词: 半乳糖苷酶,蜜二糖,葡萄糖苷酶,纤维二糖,酿酒酵母,浓醪酒精发酵
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 酒精发酵的糟液中含有一定量的糖未能被酿酒酵母有效利用,其中最多的是蜜二糖和纤维二糖。在纤维质原料酒精发酵时,纤维二糖是纤维素酶水解纤维素的反馈抑制物和纤维素酶系的主要产物,纤维素的有效酶水解需要高β-葡萄糖苷酶活的纤维素酶。在浓醪酒精发酵过程中和纤维素酶水解过程中分别添加α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,能够达到消耗蜜二糖和纤维二糖的目的,并解除纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制,但是其生产成本必然随外加酶的成本变化。本文以工业生产菌株Saccharomyces cerevisiae Y为研究对象,以基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母的构建和应用为目标,通过修饰酵母生物合成甘油的相关基因,即在酵母甘油途径关键酶基因GPD1内分别插入α-半乳糖苷酶基因mel和β-葡萄糖苷酶bgl,达到减少副产物生成、在酒精发酵过程中有效利用蜜二糖和纤维二糖的目的,从而提高酒精发酵效率、降低酒糟有机物含量。同时,在纤维素酒精发酵过程中部分解除纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用,提高纤维素利用率。通过比较不同类型的色谱分离柱及其分离条件,使用碳水化合物分离柱采用HPLC法对淀粉质原料浓醪酒精糟液成分进行分析,首次建立了同时定性定量分析酒糟清液中蜜二糖、纤维二糖及甘油的HPLC分析方法。使用该方法对不同淀粉质原料浓醪酒精发酵糟液进行分析,结果显示糟液中蜜二糖、纤维二糖的含量都在500 mg/L以上,甘油浓度在4,000-10,000 mg/L。该法快速、简单、方便,灵敏度高,分离效果良好,适用于各类发酵液及混合溶液中这几种物质的监测分析。根据文献发表的S. pombeα-半乳糖苷酶基因序列设计引物,以S. pombe基因组DNA为模板,通过PCR方法成功扩增出S. pombeα-半乳糖苷酶基因。将扩增出来的S. pombeα-半乳糖苷酶基因基因与pYX-212载体的TPI启动子融合,成功构建酵母融合表达载体pYX-MEL。通过电转化方法成功将pYX-MEL载体转化入酿酒酵母宿主菌株S. cerevisiaeW303-1A,以不含尿嘧啶的YNBG平板筛选得到阳性重组子。酶活测定表明,酿酒酵母转化子表达α-半乳糖苷酶酶活为0.81 u/mL,S. pombeα-半乳糖苷酶基因在实验室酿酒酵母中得到活性表达,并通过实验证明表达mel基因的酿酒酵母S. cerevisiae (pYX-MEL)能以蜜二糖为唯一碳源生长。根据文献发表的T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,提取总RNA,分离polyA~+ mRNA,通过RT-PCR方法成功扩增出T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因。将扩增出来的T.reeseiβ-葡萄糖苷酶结构基因与pYX-212载体的TPI启动子融合,成功构建酵母融合表达载体pYX-BGL。通过电转化方法成功将pYX-BGL载体转化入酿酒酵母宿主菌株S.cerevisiae W303-1A,以不含尿嘧啶的YNBG平板筛选得到阳性重组子。酶活测定表明,酿酒酵母转化子表达β-葡萄糖苷酶酶活为0.47 u/mL,T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因在实验室酿酒酵母中得到活性表达。酒酵母转化子S. cerevisiae (pYX-BGL)能以纤维二糖为唯
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 概述
1.2 燃料酒精
1.2.1 燃料酒精的历史与现状
1.2.2 国内外概况
1.2.3 发展燃料酒精的意义
1.2.4 我国发展燃料酒精的可行性和紧迫性
1.3 利用纤维质原料进行酒精生产
1.4 工业酵母的遗传育种
1.4.1 遗传工程
1.4.2 同源重组技术
1.4.3 工业微生物的遗传育种
1.4.4 工业酵母的遗传工程
1.4.5 工业酵母菌株重组的筛选标记
1.4.6 酿酒酵母的同源重组
1.4.7 整合型酵母转化机制
1.5 酒精发酵生产的酵母菌株及其改造
1.6 立题意义与本论文研究内容
1.6.1 我国推行燃料酒精存在的问题
1.6.2 课题意义
1.6.3 研究内容
1.7 参考文献
第二章 浓醪发酵酒精醪液的HPLC分析
2.1 实验材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要仪器与设备
2.1.3 实验方法
2.2 结果与讨论
2.2.1 标准曲线的绘制
2.2.2 分离效果
2.2.3 回收率实验
2.2.4 酒糟经过不同处理方法后的分析结果比较
2.2.5 糖分析方法小结
2.2.6 浓醪发酵酒精醪液中甘油含量的分析
2.2.7 碳水化合物分离柱分析时各物质的最低检测限
2.2.8 分析与讨论
2.3 本章小结
2.4 参考文献
第三章 酿酒酵母蜜二糖代谢途径的构建
3.1 材料与方法
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 培养基、工具酶和试剂
3.1.3 仪器与设备
3.1.4 引物设计及目的基因的PCR 扩增
3.1.5 酵母基因组DNA 的制备
3.1.6 常规基因克隆操作方法
3.1.7 S. cerevisiae W303-1A 电穿孔转化法
3.1.8 酿酒酵母细胞裂解液的制备
3.1.9 α-半乳糖苷酶酶活的测定
3.1.10 对硝基酚-吸光度标准曲线绘制
3.2 结果
3.2.1 PCR 扩增目的基因mel
3.2.2 mel 的克隆与表达
3.3 本章小结
3.4 参考文献
第四章 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建
4.1 材料与方法
4.1.1 菌种和质粒
4.1.2 培养基、工具酶和试剂
4.1.3 主要仪器和设备
4.1.4 引物设计及目的基因的PCR 扩增
4.1.5 里氏木霉总RNA 的提取
4.1.6 常规基因克隆操作方法
4.1.7 S. cerevisiae W303-1A 电穿孔转化法
4.1.8 细胞裂解液的制备
4.1.9 酶活的测定
4.1.10 对硝基酚-吸光度标准曲线绘制
4.2 结果与讨论
4.2.1 总RNA 提取及样品的分析
4.2.2 从总RNA 中纯化mRNA
4.2.3 PCR 扩增目的基因bgl
4.2.4 基因bgl 的克隆与表达
4.2.5 外源基因表达能力验证
4.3 本章小结
4.4 参考文献
第五章 酿酒酵母纤维二糖和蜜二糖代谢途径的搭建及3-磷酸甘油脱氢酶基因的敲除
5.1 材料与方法
5.1.1 菌种和质粒
5.1.2 培养基、工具酶和试剂
5.1.3 仪器与设备
5.1.4 引物设计及目的基因的PCR 扩增
5.1.5 常规基因克隆操作方法
5.1.6 S. cerevisiae Y 电穿孔转化法
5.1.7 个体与群体形态观察
5.1.8 培养液甘油测定
5.2 结果
5.2.1 重组质粒构建
5.2.2 PCR 扩增
5.2.3 目的基因在工业酿酒酵母染色体上的整合
5.2.4 整合转化子的验证
5.2.5 整合子基本性状的考察
5.3 本章小结
5.4 参考文献
第六章 工程菌的应用试验
6.1 实验材料与方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 主要仪器与设备
6.1.3 实验方法
6.2 实验结果与讨论
6.2.1 工程菌S. cerevisiae MG1 发酵试验
6.2.2 工程菌 S.cerevisiae CG1 发酵试验
6.2.3 讨论
6.3 本章小结
6.4 参考文献
第七章 酿酒酵母基因工程菌浓醪酒糟饲料的可行性研究与安全性评价
7.1 材料与方法
7.1.1 试剂与药品
7.1.2 仪器与设备
7.1.3 实验方法
7.2 结果
7.2.1 DDGS 分析
7.2.2 安全性的初步分析
7.3 本章小结
7.4 参考文献
结论与展望
论文创新点
致谢
研究生期间论文发表
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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- [4].Cu2+对酿酒酵母酒精发酵的影响及酵母应答铜逆境机理初探[D]. 贾博.中国农业大学2015
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