论文摘要
Exendin-4是由美洲西南部一种希拉毒蜥唾液腺分泌的39肽,具有与胰高血糖素样肽-1（GLP-1）相似的降血糖活性。目前已研发成为首个“模仿肠降血糖素”治疗Ⅱ型糖尿病的药物-Exenatide。但Exenatide需每天皮下注射2次,对糖尿病患者的治疗很不方便。本论文研究目的是通过对exendin-4的结构优化和肽库筛选以获得高活性exendin-4短肽模拟物,为可供口服的糖尿病药物——类肽化学药物的设计开发提供结构信息。首先,依据exendin-4结构信息对其结构进行改造,设计了一系列结构模拟物,并筛选得到活性较好的模拟物Ex4和Ex5。结构与活性间关系的研究表明,N端螺旋（LSKQMEEEA）比C端螺旋（EEEAVRL）对于激活受体更为重要,可利用易形成螺旋的3个连续Ala替换以上序列,进而达到对exendin-4进行结构优化的目的。Exendin-4序列中第13位Tyr的替换是对其进行优化的重要位点;其次,以高丰度表达GLP-1受体的RINm-5F细胞为靶标对噬菌体表面展示12肽库进行亲和筛选,得到了与exendin-4同样具有体外细胞增殖活性和GLP-1受体结合活性的12肽模拟物Ex-12PA（QPSVGMKPSPRH）。高浓度葡萄糖毒性下exendin-4和Ex-12PA对β-细胞的保护机制表明它们都可以通过调控bcl-2/bax---Casepase-3途径抑制RINm-5F细胞的凋亡,以及通过调控pdx-1基因的表达改善RINm-5F细胞的功能;此外,为了有效地检测exendin-4及其模拟物的活性,进一步改进了MTT法并建立了以结合nGLP-1R为基础,对exendin-4及模拟物进行定量分析的活性检测方法。本研究成功地对exendin-4进行了结构优化并得到了活性较好的Ex4和Ex5,增进了对exendin-4结构与活性之间关系的认识。基于高通量肽库筛选得到了高活性12肽模拟物Ex-12PA,为研发可供口服的“类肽”糖尿病药物以及与GLP-1受体间结合规律的研究提供了结构信息。
论文目录
内容提要第一章 前言第一节 Ⅱ糖尿病概述一、Ⅱ型糖尿病的发病机制二、Ⅱ型糖尿病药物研究进展第二节 GLP-1 及其类似物Exendin-4一、胰高血糖素样肽-1二、Exendin-4三、Exendin-4 的结构四、Exendin-4 与GLP-1 受体间的相互作用第三节 Exendin-4 对胰岛β-细胞改善的作用机制一、葡萄糖对胰岛β-细胞的影响二、Exendin-4 对胰岛β-细胞的改善第四节 Exendin-4 作为糖尿病药物的研发及其临床应用第五节 GLP-1R 为靶标的Ⅱ型糖尿病药物的筛选一、利用肽库筛选得到的GLP-1R 激活剂二、利用Exendin-4 突变体库筛选GLP-1R 激活剂三、利用非肽类化合物样品库筛选GLP-1R 激活剂第六节 本文设计思想第二章 材料与方法第一节 Exendin-4 及结构模拟物体外活性、稳定性与结构关系的研究一、材料与试剂二、溶液配制三、主要仪器四、实验方法1. Exendin-4 及其结构模拟物的固相合成、纯化与鉴定2. Exendin-4 及其结构模拟物体外活性测定3. Exendin-4 及其结构模拟物体外稳定性测定4. Exendin-4 及其结构模拟物光谱分析第二节 Exendin-4 的12 肽模拟物的筛选、合成与活性测定一、材料与试剂二、溶液配制三、主要仪器四、实验方法1. Exendin-4 的12 肽模拟物的筛选2. 噬菌斑的扩增3. 噬菌体单链DNA 的提取4. 噬菌体滴度测定5. Exendin-4 的12 肽模拟物的合成、纯化以及鉴定6. Exendin-4 的12 肽模拟物的活性检测7. Ex-12PA 体外稳定性检测8. Ex-12PA 体内降血糖活性测定第三节 葡萄糖毒性下Exendin-4 及Ex-12PA 对β-细胞保护机制的研究.一、材料与试剂二、溶液配制三、仪器设备四、实验方法1. RINm-5F 细胞葡萄糖毒性相关基因的检测2. Caspase-3 活性测定第四节 Exendin-4 及模拟物活性测定方法的研究一、材料与试剂二、溶液配制三、主要仪器四、实验方法1. MTT 检测方法的改进2. nGLP-1R 结合活性检测方法的建立第三章 结果与讨论第一节 Exendin-4 及结构模拟物体外活性、稳定性与结构关系的研究一、Exendin-4 结构模拟物设计二、Exendin-4 及其结构模拟物合成、纯化及其鉴定三、Exendin-4 及结构模拟物体外活性测定四、Exendin-4 及结构模拟物体外稳定性测定五、Exendin-4 及结构模拟物光谱分析六、讨论七、小结第二节 Exendin-4 的12 肽模拟物筛选、合成与活性测定一、Exendin-4 的12 肽模拟物的筛选1. 亲和筛选2. 噬菌体阳性克隆单链的提取及测序3. 亲和短肽序列分析4. Exendin-4 的12 肽模拟物的合成、纯化及鉴定5. Exendin-4 的12 肽模拟物体外活性检测6. Ex-12PA 体外稳定性检测7. Ex-12PA 体内降血糖活性测定二、讨论三、小结第三节 Exendin-4 及Ex-12PA 对β-细胞葡萄糖毒性保护机理的研究一、葡萄糖毒性下抑制RINm-5F 细胞凋亡的检测1. bcl-2 和bax 基因的检测2. Caspase-3 活性的检测二、葡萄糖毒性下改善RINm-5F 细胞功能相关基因的检测三、讨论四、小结第四节 Exendin-4 及模拟物活性测定方法的研究一、MTT 检测方法的改进1. 铺板前细胞活力计数2. 铺板细胞数目的确定二、nGLP-1R 结合活性检测方法的建立1. 原核系统nGLP-1R 的表达2. 靶分子与nGLP-1R 结合活性的测定三、讨论四、小结第五节 结论参考文献博士期间研究成果中文摘要Abstract致谢作者简历
相关论文文献
标签：模拟物论文; 噬菌体肽库筛选论文; 生物活性论文; 葡萄糖毒性论文;
