论文摘要
本研究根据Genebank中鸡白介素-1β（ChIL-1β）序列（Y15006）设计引物对，采用RT-PCR法从地方品种山地乌骨鸡的外周血淋巴细胞RNA中克隆了ChIL-1β基因，将cDNA片段克隆到PMD18-T载体，进行序列测定，并对其进行分析。山地乌骨鸡IL-1β序列在国内外是第四个报道的鸡IL-1β序列。分析结果显示：该克隆的cDNA全长804bp，编码267个氨基酸。将山地乌骨鸡IL-1β基因测序结果与Genebank上的仅有的1株IL-1β序列（Weining，K.C.等报道的序列）用DNAstar进行分析发现序列同源性99.5％，与国内邵卫星等报道的IL-1β序列同源性为99.0％，与张永霞等报道的IL-1β基因序列同源性为97.9％，将其编码的氨基酸进行同源性分析，同时将4个核苷酸序列进行进化树分析。该基因经BamHⅠ和ECORⅠ双酶切后，插入同样经BamHⅠ和ECORⅠ双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建真核表达质粒，经鉴定正确，配制分子佐剂pDNAIL-1β，与IBV DNA疫苗联合免疫7组鸡（pcDNA3.1组，IBV DNA组，pDNAIL-1β组，pDNAIL-1β+IBV DNA组，PBS组，灭活苗组，弱毒苗组）。用间接ELISA测定特异性抗体，结果表明，免疫14天时pDNAIL-1β+DNA组和弱毒苗组、灭活苗组比较差异极显著（P＜0.01），在21天pDNAIL-1β+IBV DNA组与所有实验组比较差异极显著（P＜0.01），在28天pDNAIL-1β+DNA组与DNA疫苗组比较差异显著（P＜0.05）；测定CD3+T淋巴细胞结果表明，pDNAIL-1β+IBV DNA组与IBV DNA疫苗组比较在14天差异极显著（P＜0.01），21天时pDNAIL-1β+IBV DNA组与IBV DNA疫苗组比较差异显著（P＜0.05），pDNAIL-1β+IBV DNA组与其它实验组比较均出现差异极显著（P＜0.01）；检测CD4+T淋巴细胞结果表明，7天时pDNAIL-1β+IBV DNA组与pcDNA3.1组、灭活苗组、弱毒苗组和PBS苗组比较差异显著（P＜0.05），在14-21天期间pDNAIL-1β+IBV DNA组与IBV DNA疫苗组比较，差异极显著（P＜0.01）；研究CD8+结果表明，在免疫14天，pDNAIL-1β+IBV DNA组和IBV DNA疫苗组比较差异极显著（P＜0.01），21天时与除DNA疫苗组外的其它五个实验组比较差异显著（P＜0.05）。攻毒实验结果表明，pDNAIL-1β+IBV DNA组其死亡保护率（95％）显著高于IBV DNA疫苗组（85％），与弱毒苗组的保护率相当（95％），但低于灭活苗组的保护率（100％）。综上表明pDNAIL-1β可以明显地增强IBV DNA疫苗的免疫作用，可作为一种有效的免疫增强剂。