基于糖尿病皮肤溃疡局部微环境特征初步构建组织工程皮肤的研究

论文摘要

目的糖尿病慢性皮肤溃疡难以愈合,严重危害着患者的身心健康,已成为全球公认的一个亟需解决的难题。本研究针对糖尿病皮肤溃疡局部酸微环境应用天然生物高分子材料设计新型酸敏感水凝胶,并选择神经生长因子（nerve growth factor, NGF）作为目的蛋白构建含绿色荧光蛋白的真核表达载体以获得稳定表达NGF蛋白的细胞株,进一步利用该水凝胶材料负载转基因种子细胞构筑细胞／材料三维复合物,期望实现响应酸环境刺激种子细胞控制性释放生长因子和细胞外基质以促进糖尿病皮肤溃疡愈合。方法第一部分：选择NGF作为目的片段,从健康成年人血中提取基因组DNA,根据Ensembl所提供的ENST00000369512序列和pSELECT-GFPzeo-MCS质粒的多克隆位点,在上下游引物中加入BamHⅠ和NheⅠ的限制性酶切位点序列,采用PCR技术,扩增出含前导肽及信号肽的β-NGF前体基因,并与克隆质粒pGM-T构建克隆载体pGM-T/β-NGF,经测序正确后,再将该目的片段与真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,构建含绿色荧光蛋白的真核表达载体pSELECT-GFPzeo/β-NGF,转染CHO-K1细胞,经Zeocin抗生素筛选获得稳定表达细胞系,进一步应用ELISA法检测目的蛋白的表达量,并通过噻唑蓝（Thiazolyl blue, MTT）法评价其生物学活性。第二部分：选择天然生物高分子材料壳聚糖经2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（GTMAC）进行季铵化改性后,与混合甘油磷酸钠（α-β-GP）制备出新型酸敏感水凝胶,用红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）对其进行表征,并对水凝胶的溶胀度、体外释放蛋白性能及细胞毒性进行评价；并以水凝胶材料作为支架负载转基因种子细胞构筑细胞／材料三维复合物,通过扫描电子显微镜观察其超微观结构。结果1.PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示为一长约726bp的清晰条带；2.将产物纯化后与pGM-T克隆载体连接,经蓝白斑筛选所得的阳性克隆质粒经BamH I和NheⅠ的双酶切可得到约726bp的条带,经测序证实与Ensembl所提供的序列完全相符；3.将BamHⅠ和NheⅠ双酶切所得NGF基因和表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS进行连接,经Zeocin抗生素筛选出的阳性质粒,再经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后再次得到约726 bp的条带,测序证实与Ensemb1中的序列完全相同；4.转染CHO-K1细胞,经Zeocin抗生素筛选8周后成功获得稳定表达细胞系,绿色荧光蛋白持续表达；5. ELISA法检测目的蛋白的表达量为21.78 ng/24 h/106 cells, MTT法检测其对NIH3T3细胞生长具有明显的促增殖的作用,与对照组相比有统计学意义p<0.05)；6. HTCC/GP水凝胶溶胀度良好,能响应pH变化控制释放蛋白,MTT法检测该水凝胶不影响细胞增殖,对细胞没有毒性,组间存在差异p<0.05)；将该水凝胶负载转基因CHO-K1细胞构成细胞/材料三维复合物,扫描电镜显示其成互穿网络结构,孔径比较均一,细胞黏附良好。结论1.首次成功构建了含有绿色荧光蛋白双顺反子的pSELECT-GFPzeo-β-NGF真核表达载体；稳定转染真核细胞CHO-K1获得持续表达NGF蛋白的CHO-K1种子细胞系,经培养所分泌目的蛋白可有效促进NIH3T3细胞增殖,具有较强的生物学活性；2.基于天然生物高分子壳聚糖材料成功制备出新型pH敏感互穿网络结构的HTCC/GP水凝胶,该水凝胶材料具有良好生物相容性、溶胀性,能够响应pH环境控制蛋白药物释放；3.成功构筑负载转基因CHO-K1种子细胞的水凝胶三维复合物,研究表明该支架材料可为种子细胞在支架材料上黏附、增殖及细胞间通讯提供理想的微环境,有望在溃疡表面形成一个仿生皮肤环境以调控糖尿病溃疡再生修复过程,为针对溃疡局部微环境特征设计组织工程皮肤奠定了一定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、NGF真核表达载体及转基因CHO种子细胞的构建
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.1.4 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 NGF目的基因的获取及重组克隆载体的构建
• 1.2.2 含绿色荧光蛋白重组表达载体的构建及鉴定
• 1.2.3 重组表达载体转染CHO细胞及稳定表达
• 1.2.4 目的蛋白表达量的测定
• 1.2.5 含NGF的上清作用后的NIH3T3细胞的生长情况
• 1.3 讨论
• 1.3.1 糖尿病皮肤溃疡的特点
• 1.3.2 神经生长因子的生物学特性
• 1.3.3 人β-NGF前体基因的PCR扩增
• 1.3.4 含绿色荧光蛋白重组表达载体的构建
• 1.3.5 阳离子脂质体转染法
• 1.3.6 受体细胞的选择
• 1.4 小结
• 二、基于新型酸敏感材料的组织工程皮肤的初步构建
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 主要材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 HTCC的合成与表征
• 2.2.2 HTCC/GP的制备
• 2.2.3 HTCC/GP水凝胶的表征
• 2.2.4 水凝胶溶胀率的测定
• 2.2.5 胰岛素的体外释放实验
• 2.2.6 HTCC/GP水凝胶细胞毒性实验
• 2.2.7 种子细胞/水凝胶材料黏附性实验
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述 慢性皮肤溃疡的病因及治疗研究进展
• 综述参考文献
• 致谢