反义抑制鲨烯合酶基因表达对产紫穗槐烯酵母工程菌生物合成的影响

论文摘要

青蒿素是目前治疗疟疾的首选药物,但天然来源受到多种因素制约,通过基因工程方法生产其中间体青蒿酸、进而化学半合成青蒿素是解决资源问题的重要途径之一。为构建青蒿酸高产酵母工程株系,本论文开展了紫穗槐-4,11-二烯（简称:紫穗槐烯,AD）的生物合成途径工程研究并取得如下进展:1.ADS整合型酿酒酵母工程菌的构建:根据同源双交换的原理,构建可以在酿酒酵母的λDNA序列处进行双交换的紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）基因（ADS）的整合载体。λDNA序列在酿酒酵母基因组中大约有200个拷贝,把外源基因整合在这个位点可以大大提高外源基因在酿酒酵母中表达的拷贝数。构建ADS整合载体首先要把酿酒酵母的强启动子ADH和终止子连在载体上,然后把ADS基因亚克隆到强启动子ADH和终止子之间,再连接一个营养缺陷型筛选标记基因URA3,还要把λDNA序列分成两个交换臂连在所有待整合基因的两端。用这个构建好的载体转化营养缺陷型酿酒酵母,筛选出ADS整合型工程菌。得到的菌株经过发酵培养后,用GC-MS检测发酵产物,经过计算,其中一株工程菌产紫穗槐烯的量达到117.0mg·L-1。2.ADS整合型工程菌和ADS附加体型工程菌AD产率比较:将本论文构建的ADS整合型工程菌和实验室以前构建的ADS附加体型工程菌各选3株,同时发酵培养,然后进行发酵液提取和GC-MS检测。结果显示,整合型工程菌的AD产率明显高于附加体型工程菌的AD产率（P＜0.01）。3.鲨烯合酶基因（SQS）反义RNA表达载体的构建:设计反义RNA时,人们普遍应用由翻译起始位点向上下游延伸0.5kb—3.0kb的片段作为重组质粒的逆向插入序列,5′和3′非翻译区（UTR）往往具有良好的效果。本研究把SQS mRNA的4个基因片段:SQS1（5′-UTR）,SQS7（3′-UTR）,SQS3*4（5′UTR加5′编码区）以及SQS5*6（3′-编码区加3′-UTR）分别反向插入到pYeDP60的GAL10/CYC1半乳糖诱导型启动子的下游,构建成4个相应的SQS反义RNA表达载体pYeD/SQS1、pYeD/SQS7、pYeD/SQS3*4、pYeD/SQS5*6。4.SQS反义RNA表达对AD酿酒酵母工程菌生物合成的影响:用上述4个SQS反义RNA表达载体分别转化ADS整合型酵母工程菌,得到含有SQS反义RNA的ADS酵母工程菌。用GC-MS检测发酵产物中的AD和鲨烯（SQ）的量,初步研究发现,转入SQS反义表达载体后,鲨烯（SQ）和AD的产率比转入前均有所下降。可能的原因是:所分析的重组菌样本量比较少,而这些重组菌中转入的反义基因片段除了引起SQS表达下调以外,还引起ADS表达的部分抑制。本论文还开展了重组SARS未知功能小蛋白的大肠杆菌表达、纯化及抗体制备研究:5.SARS-CoV未知功能小蛋白的表达、纯化、鉴定及抗体制备:在大肠杆菌BL21trxB（DE3）中,表达了重组SARS-CoV未知功能小蛋白X4、X5和ORF10。对X5和ORF10重组蛋白进行了Ni+亲和层析纯化。ORF10纯化时,用低浓度咪唑(60mM·L-1)梯度洗脱,获得22KD和44KD两个蛋白条带;在用高浓度咪唑(120mM·L-1)梯度洗脱时,只有分子量大小为22KD的蛋白条带。制备这两种条带并送中国科学院生物物理研究所进行LC-MS/MS测定,结果显示:在22KD和44KD两种蛋白样品中均能检测到与ORF10蛋白序列100%同源的若干个片段,两种样品所测得的片段分别占总ORF10蛋白序列理论值的38.3%和45.1%,由此推测:所获得的重组蛋白就是ORF10蛋白,其中44KD的蛋白条带可能是该蛋白的二聚体的形式,这也很可能是病毒进入人体后起作用的形式。在纯化X5蛋白时,用和ORF10一样的纯化方法却没有得到X5蛋白,推测X5蛋白是以包涵体形式存在。用尿素变性溶解包涵体,然后所得上清用亲和柱层析,Tris缓冲液复性的办法得到了高产率、高纯度的蛋白。用复性后的蛋白免疫兔子得到了高效价的X5蛋白的抗血清。Western免疫印迹显示尿素变性纯化再复性的X5蛋白的抗体能够和菌体中表达的X5蛋白结合。以包涵体形式表达的X5蛋白纯化后的产率达到93.3mg·L-1是以非包涵体形式表达的ORF10蛋白纯化后产率的5倍。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 青蒿素（ARTEMISININ）
• 1.1.1 青蒿素及其衍生物的研究历史
• 1.1.2 化学结构、物理性质
• 1.1.3 作用机制及药理作用
• 1.1.3.1 作用机制
• 1.1.3.2 其他药理作用
• 1.1.4 青蒿素的来源
• 1.1.4.1 野生黄花蒿中提取
• 1.1.4.2 青蒿素的全合成
• 1.1.4.3 组织培养
• 1.1.4.4 青蒿素的生物合成
• 1.2 青蒿素生物合成研究进展
• 1.2.1 植物中青蒿素合成过程的研究
• 1.2.2 青蒿素生物合成研究过程
• 1.3 本论文的实验设计思路
• 1.3.1 研究意义
• 1.3.2 研究基础
• 1.3.3 实验设计
• 1.3.3.1 紫穗槐烯酵母工程菌的构建
• 1.3.3.2 SQS反义RNA表达载体的构建
• 1.3.3.3 转化紫穗槐烯酿酒酵母工程菌
• 1.3.3.4 反义mRNA检测
• 参考文献
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 工具酶类
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 分子量标准
• 2.1.5 培养基成分
• 2.1.6 其他PCR相关试剂
• 2.1.7 其他试剂
• 2.1.8 实验仪器
• 2.1.9 主要溶液及试剂配制
• 2.1.9.1 培养基
• 2.1.9.2 溶液
• 2.1.10 生物信息学软件
• 2.1.11 菌株、质粒和引物
• 2.1.12 抗生素
• 2.1.13 氨基酸及生长物质
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌相关实验方法
• 2.2.2 与酿酒酵母相关的实验操作
• 2.2.2.1 酵母质粒的提取
• 2.2.2.2 酿酒酵母感受态的制备
• 2.2.2.3 酿酒酵母转化
• 2.2.2.4 酵母工程菌的筛选
• 2.2.2.5 酵母工程菌的发酵培养
• 2.2.2.6 酵母总DNA的提取（酸化玻璃珠法）
• 2.2.2.7 酿酒酵母总RNA的提取
• 2.2.2.8 RT-PCR
• 2.2.3 蛋白分析与纯化相关技术
• 2.2.3.1 不同饱和度硫酸铵分级盐析
• 2.2.3.2 蛋白的透析处理
• 2.2.3.3 His-Tag对蛋白的纯化
• 参考文献
• 第三章 SQS反义RNA对紫穗槐烯酵母工程菌生物合成的影响
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 整合型紫穗槐烯合酶基因酵母工程菌的构建
• 3.1.1.1 整合载体pADSλ和pADSmλ的构建
• 3.1.1.1.1 整合载体pADSλ的构建
• 3.1.1.1.2 整合载体pADSmλ的构建
• 3.1.2 整合型紫穗槐烯酵母工程菌的构建
• 3.1.2.1 整合载体pADSλ和pADSmλ对酿酒酵母的转化
• 3.1.2.2 紫穗槐烯酵母工程菌鉴定
• 3.1.3 W303A[pADSλ]酵母工程菌发酵及产物鉴定
• 3.1.4 附加体型和整合型ADS工程菌产率对比
• 3.1.5 SQS反义RNA表达载体的构建
• 3.1.5.1 基因克隆
• 3.1.5.2 SQS反义RNA表达载体构建
• 3.1.5.2.1 pYeD/SQS1构建
• 3.1.5.2.2 pYeD/SQS7构建
• 3.1.5.2.3 pYeD/SQS3*4构建
• 3.1.5.2.4 pYeD/SQS5*6构建
• 3.1.6 SQS反义RNA表达载体转化AD酵母工程菌
• 3.1.7 含SQS反义表达载体的AD酵母工程菌鉴定
• 3.1.7.1 PCR鉴定
• 3.1.7.2 GC-MS鉴定
• 3.1.7.3 实时定量PCR
• 3.2 实验结果
• 3.1.1 紫穗槐烯酵母工程菌的构建
• 3.1.1.1 酿酒酵母整合载体pADSλ和pADSmλ的构建
• 3.1.1.2 pMECAURAλ1的鉴定
• 3.1.1.3 pMECAURAλ的鉴定
• 3.1.1.4 pGEMA/ADS的鉴定
• 3.1.1.5 pADSλ的鉴定
• 3.1.1.6 pGEMA/ADSm的鉴定
• 3.1.1.7 pADSmλ的鉴定
• 3.1.2 整合型紫穗槐烯酵母工程菌鉴定
• 3.1.3 紫穗槐烯酵母工程菌中尿嘧啶基因的反相筛选
• 3.1.4 酵母工程菌的紫穗槐烯产率
• 3.1.5 整合型与附加体型工程菌紫穗槐烯产率的对比
• 3.1.6 SQS反义RNA表达载体的构建
• 3.1.7 含SQS反义RNA表达载体的AD酵母工程菌鉴定
• 3.1.7.1 PCR鉴定
• 3.1.7.2 GC-MS鉴定
• 3.1.7.3 实时定量PCR
• 3.1.7.3.1 引物设计
• 3.1.7.3.2 实时定量预实验
• 3.3 讨论
• 第四章 重组SARS-COV未知功能小蛋白表达、纯化及抗体制备
• 4.1 前言
• 4.1.1 冠状病毒
• 4.1.2 SARS-CoV病毒的基因序列
• 4.1.3 关于SARS-CoV基因组编码的蛋白
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 X4、X5和ORF10基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.2.2 X5、ORF10蛋白的纯化
• 4.2.2.1 待纯化样品的准备
• 4.2.2.2 层析柱的准备和上样
• 4.2.2.3 冲柱
• 4.2.2.4 咪唑梯度洗脱
• 4.2.2.5 SDS-PAGE电泳
• 4.2.2.6 透析
• 4.2.2.7 浓缩
• 4.2.2.8 蛋白定量
• 4.2.3 重组X5和ORF10蛋白的LC-ESI-MS/MS鉴定
• 4.2.4 X5蛋白的抗体制备和Western Blot鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 X4、X5和ORF10基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.3.2 重组X5和ORF10蛋白纯化
• 4.3.3 LC-ESI-MS/MS结果
• 4.3.4 蛋白纯化、定量
• 4.3.5 Western Blot鉴定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于ORF10蛋白
• 4.4.2 关于X5蛋白
• 4.4.3 关于融合蛋白
• 4.4.4 关于蛋白纯化
• 4.4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 全文总结
• 第六章 反义RNA技术及应用（综述）
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历