重组脂肪酶高效表达菌株的筛选及条件优化

论文摘要

脂肪酶作为一种重要的工业用酶,在食品加工、精细化工、医药合成和生物能源等领域都有广泛的应用。多种微生物脂肪酶都已经被克隆和表达,常用的表达体系有大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系。前者是研究最为透彻的原核表达体系,后者是近年来发展最为成功的真核表达体系。脂肪酶规模化应用的前提是要获得高效表达的基因工程菌。因此,不同来源的脂肪酶基因采取了不同的构建和筛选基因工程菌的方法。对于BTLm脂肪酶,采用替换酵母偏爱密码子、体外合成等先进定向进化技术对脂肪酶基因进行改良研究,获得降解对硝基棕榈酸苯酯（p-Nitrophenyl palmitate,pNPP）能力和对碱性环境耐受性大幅提高的突变基因btlm,构建了高效表达的重组毕赤酵母基因工程菌。对于铜绿假单胞菌脂肪酶,构建了重组大肠杆菌基因工程菌。研究内容主要分为以下两大部分：1、将前期已成功构建的脂肪酶基因表达载体pPICZaA-btlm,酶切线性化后,通过电转化法整合到Pichia pastoris GS 115菌株细胞中；然后通过菌落PCR鉴定阳性重组子后,通过梯度浓度的zeocin平板筛选出高拷贝重组子；最后对高拷贝的重组阳性菌株12“进行诱导表达,并进行了表达条件优化,确定最佳培养条件；采用pNPP法检测脂肪酶活力,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白是否表达,并分析了其降解pNPP的特性。2、从铜绿假单胞菌（HS-D38）中克隆到1个脂肪酶基因lipAB,序列分析表明该基因编码区全长2007bp,编码1段由312个氨基酸残基组成的脂肪酶（LipA）和1段由283个氨基酸残基组成的伴侣蛋白（LipB）,与已报道的铜绿假单胞菌脂肪酶基因（AB008452）同源性为99.4%。构建并筛选了脂肪酶基因lipAB的E. coli重组表达菌株,LipA和LipB分别实现了表达,且LipA在LipB的协助下具有活性。本研究解决了脂肪酶的转酯能力和高效表达等关键技术问题,利用P.pastoris真核表达系统成功实现了BTLm脂肪酶的高效表达,并利用E.coli原核表达系统实现了lipAB基因的活性表达。为后续分离纯化工作以及酶法生产生物柴油的研究奠定了良好基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 脂肪酶研究现状
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的结构特点
• 1.1.3 脂肪酶的应用研究
• 1.2 微生物脂肪酶资源
• 1.3 脂肪酶基因的筛选及改良
• 1.3.1 脂肪酶基因的筛选
• 1.3.2 脂肪酶基因的改良
• 1.4 重组脂肪酶基因工程菌的构建
• 1.4.1 外源基因的大肠杆菌表达系统
• 1.4.2 外源基因的毕赤酵母表达系统
• 1.4.3 外源基因的其他表达体系
• 1.4.4 外源基因表达条件的优化策略
• 1.5 本研究的目的、内容及意义
• 第二章 重组BTLm脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 化学试剂,工具酶与试剂盒
• 2.1.3 主要缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 外源基因转化毕赤酵母
• 2.2.2 高拷贝重组菌株的筛选与诱导表达
• 2.2.3 pNPP法测定酶活体系
• 2.2.4 鉴定重组蛋白的表达
• 2.2.5 重组脂肪酶降解pNPP的特性研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 重组BTLm脂肪酶酵母菌株的筛选
• #重组菌株产酶条件的优化与高效表达'>2.3.2 12^#重组菌株产酶条件的优化与高效表达
• 2.3.3 重组BTLm脂肪酶的特性研究
• 2.4 讨论
• 第三章 铜绿假单胞菌脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 化学试剂,工具酶与试剂盒
• 3.1.3 主要缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 基因组DNA的提取、纯化和质量鉴定
• 3.2.2 脂肪酶lipAB基因的扩增
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 铜绿假单胞菌基因组DNA分离与鉴定
• 3.3.2 重组质粒pET-lipAB的构建
• 3.3.3 LipAB脂肪酶高效重组菌株的筛选及表达
• 3.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表论文
• 致谢