间充质干细胞移植治疗急慢性肝损伤的实验研究

论文摘要

本实验分为体内、体外两部分。体外实验中首先采用组织块贴壁培养法分离、纯化、扩增和冻存人脐带MSCs,MTT法测定P7人脐带MSCs生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期及表面标志,透射电镜观察MSCs超微结构,并检测其在成骨、成脂肪细胞诱导液中的横向分化能力。而后将P7 MSCs培养在DMEM/F12+10%FBS+HGF 20ng/ml +bFGF10ng/ml+OSM 20ng/ml的诱导体系中,诱导后不同时间点采用免疫细胞化学检测AFP、ALB、CK18等肝系细胞的标志;并检测培养上清中AFP、ALB及尿素含量;采用PAS法检测诱导细胞是否出现糖原;并在电镜下观察细胞超微结构的变化。体内实验中首先从Wistar大鼠骨髓中分离、纯化、扩增MSCs,取P5对数生长期细胞用荧光染料Hochest33342标记后,分别经尾静脉、门静脉、肝内注射三种途径移植于CCl4造成的大鼠急性肝损伤模型体内;经门静脉、肝内注射途径移植于CCl4制造的大鼠慢性肝损伤模型体内。移植后不同时间取材,通过血清学、病理学检测移植效果,探讨MSCs移植后修复急、慢性肝损伤的可行性,以及何种途径移植更有效。结果显示70%以上人脐带MSCs处于G0/G1期,为正常二倍体细胞,强烈表达CD105、CD90、CD44,基本不表达CD34、CD31、CD45。具有处于原始状态下细胞超微结构的特点和自我更新能力,并可向成骨细胞和脂肪细胞分化,复苏后人脐带MSCs的形态及生长特性没有明显变化。而且,人脐带MSCs可在体外诱导分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞,联合应用HGF+bFGF+OSM比应用HGF+bFGF的诱导分化效率高。体内试验中,经门静脉、肝内注射途径移植MSCs,对急、慢性肝损伤具有修复作用,肝内注射途径优于门静脉途径。本研究的创新之处:通过组织块贴壁培养法,系统地建立了稳定的人脐带MSCs体外分离、纯化、扩增培养及冻存体系,为人脐带MSCs最终应用于临床奠定了基础,目前国内外均未见报道;确立了高效诱导人脐带MSCs体外向肝样细胞分化的诱导体系,可为肝细胞移植、生物人工肝、肝组织工程提供大量种子细胞,国内未见报道;通过检测不同途径移植的MSCs在急、慢性肝损伤模型中的定位、分化及功能表达,确立了有效的移植途径,从而探讨了新的治疗修复急、慢性肝损伤方法,目前国内未见系统报道。

论文目录

• 提要
• 英文缩略词表
• 第1章 前言
• 第2章 文献综述
• 2.1 间充质干细胞的特点
• 2.2 间充质干细胞的可塑性
• 第3章 人脐带MSCs 的分离、培养及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第4章 体外诱导人脐带MSCs 向肝样细胞分化的实验研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 第5章 同种异体大鼠骨髓MSCs 移植修复急性肝损伤的实验研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 第6章 同种异体大鼠骨髓MSCs 移植修复慢性肝损伤的实验研究
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果
• 6.3 讨论
• 6.4 结论
• 第7章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间的科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract