吡咯喹啉醌三锂干预阿尔茨海默病的实验研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种中枢神经系统退行性疾病,临床上以进行性的认知功能损害和特征性的病理学改变为主要特征。迄今为止,仍然缺乏有效的防治阿尔茨海默病的药物和治疗手段,目前临床使用的脑内胆碱酯酶抑制剂（如石杉碱甲和多奈哌齐等）和非竞争性NMDA受体拮抗剂（美金刚）并不能阻止AD病情的进展；被认为最有前景的p-淀粉样蛋白（β-amyloid,Ap）疫苗治疗也被证明不能抑制痴呆症状和病情的进展,尽管它确实有清除脑内Ap沉积和老年斑的作用,近年来,基于Ap假说研究的诸多新药临床试验相继失败促使我们反思目前的AD治疗研究策略,寻找低毒、多作用靶点的新药或“鸡尾酒疗法”成为AD防治研究中的热点。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是参与糖代谢的主要限速酶之一。GSK-3在脑中高表达,除了参与糖代谢外,还与很多生理病理学过程相关。近年来的研究发现,GSK-3也是参与AD发病过程的重要因素,AD患者脑内GSK-3活性显著增高,GSK-3信号通路能通过双通道作用机制同时调控Aβ产生和Tau蛋白磷酸化而受到AD研究学者的广泛重视。因此,通过调制GSK-3信号通路功能防治AD被赋予极高的期望。然而,包括氯化锂等在内的、目前已知的GSK-3抑制剂由于毒性过大而限制了其临床应用。锂盐作为第一个被证明的GSK-3抑制剂虽然用于临床治疗双相精神障碍已经超过50年,但由于极窄的治疗窗和对老年人群过大的副作用而难以用于AD的临床治疗。因而,寻找低毒性的GSK-3抑制剂也成为AD研究热点之一。吡咯喹啉醌三锂（tri-lithium pyrroloquinoline quinonein, Li3PQQ,分子式：C14H3N2O8Li,分子量：348）是我们自己合成的、具有自主知识产权的小分子有机锂盐。锂盐作为GSK-3抑制剂已经证明显著抑制Aβ沉积和Tau蛋白磷酸化、减少它们在神经细胞内外的沉积和改善胰岛素抵抗与糖代谢紊乱的作用。吡咯喹啉醌作为新近发现的B族维生素,被证明具有显著促进细胞线粒体增生和功能、拮抗氧化损伤、减少Ap集聚和毒性等多种作用。因而,Li3PQQ兼具改善线粒体功能、抗氧化损伤和抑制GSK-3介导的tau蛋白磷酸化与Ap形成、抑制神经变性性病理损害发生等作用,是有效的多靶点防治AD候选药物之一。这里,我们采用昆明鼠进行急性毒性试验,研究Li3PQQ的毒性作用；利用APP/PS1双转基因小鼠模型研究Li3PQQ的药理药效以及作用机制。论文的第一部分研究Li3PQQ急性毒性试验及对血液学相关指标的影响：①通过观察昆明鼠口服受试物Li3PQQ后的中毒反应及死亡情况,用于初步评价受试物安全性,并为后续试验的剂量设计提供参考依据。挑选健康昆明小鼠,采用上下法,根据在AOT425StatPgm1.0中设定的给药剂量给药,同时设阳性对照氯化锂（lithium chloride, LiCl）组。Li3PQQ按790mg/kg、2500mg/kg给药后10-15min观察到部分小鼠活动减少,约20min～1h后恢复；5000mg/kg给药后10min左右观察到活动减少和闭眼,部分动物约2小时后恢复,部分动物在给药后死亡,死亡发生在48小时以内。LiCl370mg/kg,1160mg/kg给药后无明显异常,5000mg/kg组全部死亡,死亡发生在给药后2-20小时内,Li3PQQ组雄性（≧2500mg/kg）及雌性（5000mg/kg）与较低剂量组（790mg/kg）相比体重增长缓慢。本次试验测得Li3PQQ的半数致死量（Median lethal dose,LD50）为雄性>5000mg/kg,雌性5000mg/kg（95%可信区间为3308mg/kg～5400mg/kg）。阳性对照品LiCl的LD50为2512mg/kg（95%可信区间为1160mg/kg～5000mg/kg）。②通过检测给予Li3PQQ1.5、3、6rng/kg8周的APP/PS1双转基因小鼠的血常规及生化指标,来评价L13PQQ的毒性作用。20周龄的APP/PS1双转基因及同窝野生型对照小鼠分别给予Li3PQQ1.5、3、6mg/kg,安理申（donepezil,DNP）1.5mg/kg,美金刚（memantine, MMT）3mg/kg,野生型溶剂（WT, vehicle）组,转基因溶剂（TG, vehicle）组。给药8周后取血检测血常规,肝肾功,血糖,血甘油三酯,胆固醇等指标,发现Li3PQQ三个剂量组均不影响APP/PS1双转基因小鼠的血常规及生化指标,为证实其毒性及副作用小又提供了一个有力的证据。论文的第二部分研究Li3PQQ的药效作用、改善认知功能研究及突触可塑性研究。以不同年龄（20周龄、40周龄）的APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,采取灌胃的给药方式,分别给予Li3PQQ1.5mg、3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg,阳性对照药安理申（donepezil, DNP）1.5mg/kg,锂盐对照药LiCl5mg/kg、100mg/kg,吡咯喹啉醌对照组Na3PQQ14mg/kg,野生型溶剂（WT, vehicle）组,转基因溶剂（TG, vehicle）组。给药8周后,进行Morris水迷宫行为学试验,研究Li3PQQ不同剂量组空间学习记忆功能的变化；同时研究APP/PS1小鼠海马CA1区0节律刺激（Theta-burst stimulate,TBS）诱导的长时程增强的变化,进行突触可塑性研究。研究证实：Li3PQQ3mg/kg,6mg/kg口服给药8周均能改善20周龄APP/PS1双转基因小鼠的空间学习记忆损害,同时Li3PQQ12mg/kg口服给药8周均能改善20周龄、40周龄APP/PS1双转基因小鼠的空间学习记忆损害及海马CA1区的长时期增强,增强其突触可塑性。本论文的第三部分及第四部分研究Li3PQQ给药后APP/PS1小鼠的病理学表现及作用机制。采用免疫组织化学染色检测AD的两大病理指标：淀粉样斑块和神经原纤维缠结,酶联免疫吸附实验检测皮层的Aβ1-42含量,免疫蛋白印迹实验检测皮层的磷酸化tau蛋白含量；同时通过免疫蛋白印迹实验和酶活试剂盒检测GSK-3,GSK-3α, GSK-3β,β淀粉样结合乙醇脱氢酶（Aβ-binding alcohol dehydrogenase,ABAD）的表达量及活性,探讨相关作用机制。研究发现Li3PQQ3、6、12mg/kg均能够减少APP/PS1双转基因小鼠皮层淀粉样斑块的数目、面积及磷酸化tau蛋白的表达量,而这一作用是通过抑制GSK-3、GSK-3α、GSK-3β的活性及增强ABAD的活性来实现的。本文通过急性毒性试验及血液生化指标检测证实Li3PQQ是低毒的有机小分子锂盐,同时又利用不同年龄段的APP/PS1双转基因小鼠模型研究其药理药效和相关的作用机制,从而证实吡咯喹啉醌三锂是低毒、高效的多靶点治疗AD的候选分子,有可能给AD病程修饰治疗带来突破性影响,产生巨大的社会和经济效益。

论文目录

• 本文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分：吡咯喹啉醌三锂的合成、急性毒性研究及血液、生化指标检测
• 前言
• 第一章 吡咯喹啉醌三锂急性毒性研究
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 第二章 慢性口服Li3PQQ后APP/PS1转基因小鼠的血液及生化指标检测
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 讨论
• 第二部分：吡咯喹啉醌三锂的药效及改善认知功能研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分：吡咯喹啉醌三锂减轻APP/PS1小鼠病理损害的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分：吡咯喹啉醌三锂防治阿尔茨海默病的作用机制研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间完成及发表的论文
• 致谢