聚β-羟基丁酸对苏云金芽胞杆菌BMB171crylAc代谢的影响

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是一种革兰氏阳性细菌,广泛存在于自然界中,在稳定期中后期能形成芽胞,而且其体内能够产生一种杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins, ICPs）,对某些昆虫幼虫有着明显的毒杀作用。Bt在营养丰富的培养基中生长时,能积累聚-β-羟基丁酸（PHB）,当环境中营养贫乏后,在芽胞形成期早期被快速再利用。前期研究结果显示,BMB171cry1Ac敲除PHB合成基因之后,菌体在稳定期中后期不能正常形成芽胞和晶体。本研究采用核磁共振和高效液相色谱技术全面检测了实验室构建的BMB171cry1Ac和BMB171PHB-cry1Ac两株工程菌不同生长时期的胞内外代谢物质,并进行了代谢分析。本研究将为以后的代谢分析研究工作提供良好的理论支持。首先,通过对差异物质进行分析,构建了PHB对胞内代谢影响的综合代谢网络图。其次,从核磁共振检测结果中,我们发现PHB合成基因缺失突变株中核苷代谢以及磷酸戊糖途径发生了显著的变化,从而推测PHB合成基因的缺失很可能是通过影响胞内的能量代谢循环,进而影响芽胞和晶体的形成以及其他的代谢过程。因此,我们利用高效液相色谱法对胞内主要能量物质（ATP、ADP、AMP、NAD+及NADP）的含量进行了检测,实验前对样品的预处理以及从流动相的组成、流速、pH等方面对同时检测这5种物质的条件进行了优化。结果表明,PHB不能积累不仅导致芽胞和晶体不能正常形成,而且还引起了胞内的诸多代谢过程的变化。比如有机酸的大量产生致使培养基中pH值发生明显变化、胞内有氧代谢途径被抑制、脂肪酸的过度消耗、氨基酸代谢发生明显变化、核苷代谢异常、葡萄糖的消耗速度急剧加速以及菌体在对数前期生长速度加快等。我们认为可能是突变株中PHB合成受到阻遏影响了胞内核苷代谢,进而导致菌株内能量代谢循环受到抑制,从而引起了上述代谢过程的变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 縮略语
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌研究进展
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫机制
• 1.1.3 苏云金芽胞杆菌的应用
• 1.2 聚-β-羟基丁酸（PHB）的研究进展
• 1.2.1 聚-β-羟基丁酸（PHB）简介
• 1.2.2 细菌中PHB的研究现状
• 1.2.3 Bt中PHB的研究现状
• 1.3 代谢组学概况
• 1.3.1 代谢组学发展现状
• 1.3.2 微生物代谢组学研究方法
• 1.3.2.1 快速取样
• 1.3.2.2 灭活
• 1.3.2.3 代谢物的提取
• 1.3.2.4 微生物代谢组学的分析平台
• 1.3.3 代谢组学检测方法
• 1.3.3.1 核磁共振方法简介
• 1.3.3.2 高效液相色谱简介
• 1.4 本研究课题的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素及其工作浓度
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.1.5 相关试剂与缓冲液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 生长曲线的测定
• 2.2.2 菌体形态观察
• 2.2.3 代谢物的核磁共振检测
• 2.2.3.1 菌株培养
• 2.2.3.2 样品的收集与保藏
• 2.2.3.3 样品的预处理
• 2.2.3.4 NMR检测与数据采集
• 2.2.3.5 NMR数据的多变量统计分析
• 2.2.3.6 代谢网络分析
• 2.2.4 能量代谢物质的高效液相色谱的检测
• 2.2.4.1 实验试剂及仪器
• 2.2.4.2 取样、保藏
• +和NADP混合物的高效液相色谱检测条件的优化'>2.2.4.3 ATP、ADP、AMP、NAD⁺和NADP混合物的高效液相色谱检测条件的优化
• 2.2.4.4 精密度实验
• +和NADP标准品的标准曲线的绘制'>2.2.4.5 ATP、ADP、AMP、NAD⁺和NADP标准品的标准曲线的绘制
• 2.2.4.6 能量代谢物质的HPLC检测
• 3 结果与分析
• 3.1 BMB171cry1Ac和BMB171PHBˉcry1Ac两菌株的生长差异
• 3.2 BMB171cry1Ac和BMB171PHBˉcry1Ac的形态差异
• 3.3 核磁共振检测结果与分析
• 3.3.1 BMB171cry1Ac和BMB171PHBˉcry1Ac胞内提取物的检测结果差异
• 3.3.1.1 两菌株细胞内提取物核磁共振检测图谱
• 3.3.1.2 两菌株细胞内提取物差异物质归属
• 3.3.2 BMB171cry1Ac和BMB171PHBˉcry1Ac胞内提取物的检测结果差异
• 3.3.2.1 两菌株细胞外提取物核磁共振检测结果图谱
• 3.3.2.2 两菌株细胞外培养基差异物质归属
• 3.3.3. BMB171cry1Ac和BMB171PHBˉcry1Ac的代谢差异
• 3.4. 液相色谱条件优化和检测结果
• 3.4.1 优化的最佳检测条件
• 3.4.2 精密度实验
• +和NADP标准品的标准曲线'>3.4.3 ATP、ADP、AMP、NAD⁺和NADP标准品的标准曲线
• 3.4.4 检测结果
• 3.4.4.1 两菌株在不同生长时期的能荷水平
• +在各自的生长时期内的变化趋势'>3.4.4.2 两菌株内NADP和NAD⁺在各自的生长时期内的变化趋势
• 3.5 PHB合成基因的缺失对BMB171cry1Ac代谢的影响
• 3.5.1 碳水化合物代谢分析
• 3.5.2 有机酸代谢分析
• 3.5.3 氨基酸代谢分析
• 3.5.4 核苷酸代谢与能量代谢分析
• 4. 讨论
• 4.1 高效液相色谱条件的优化
• 4.2 合成杀虫晶体蛋白及芽胞的能量来源
• 参考文献
• 致谢