重组双功能水蛭素体内分析方法研究及在临床试验中的应用

论文摘要

水蛭素是存在于水蛭唾液中的最为重要的一种活性成分,是一种直接凝血酶抑制剂,能与凝血酶直接结合,抑制凝血酶的活性,产生抗凝作用,是临床上一种安全有效的治疗血栓的药物。2003年,复旦大学教育部分子医学重点实验室成功地将具有抗血小板集聚活性的（RGD）编码顺序与水蛭素的cDNA相融合,构建了含有RGD编码顺序的双功能水蛭素cDNA克隆,经过发酵,分离和纯化后获得了具有抗凝血酶和抗血小板集聚双重功能的重组双功能水蛭素（r-RGD-Hirudin,Bifunctional Hirudin,BFH）。本课题对重组双功能水蛭素体内分析方法进行了研究,建立了液相色谱—质谱联用法（LC-MS）用于人血中重组双功能水蛭素的浓度测定,和毛细管电泳—质谱联用法（CE-MS）用于人尿中重组双功能水蛭素的浓度测定。两种方法的突出优点在于通过样品前处理技术的改进（LC-MS）和在线柱上浓集技术的改进（CE-MS）使方法灵敏度得到极大的改善。目前,这两种方法已经成功应用于重组双功能水蛭素的一期临床耐受性试验中。LC-MS法中采用了超滤配合冷冻干燥技术,分离和浓集血清样品中的重组双功能水蛭素分子,克服了通常的血样前处理技术对于水溶性蛋白类药物无能为力的难点,在样品前处理方面具有创新性。LC-MS法作为一种水蛭素的直接测定方法,简便易行、数据可靠,相比文献报道的各类直接和间接测定法在方法学的各个方面都具有优势。在一期临床耐受性试验中,按照盲样程序成功地对4个不同剂量组志愿者血清中的重组双功能水蛭素浓度进行了测定,并且和常规的血液学指标结果作了比较。结果显示,本课题所建立的LC-MS法,最低定量浓度达到25ng/mL,完全能够满足对血中重组双功能水蛭素浓度测定的要求,为其进一步获得其人体药物动力学参数以及相关的临床试验研究提供了有力的手段和技术保证。CE-MS法中采用了毛细管在线柱上浓集技术（动态pH接界）,在不需要对尿样进行前处理,也无需对硬件设备进行提升的情况下,即可克服CE方法由于进样量少而造成的浓度灵敏度低的缺点。本课题所建立的方法不仅简便快速,消耗溶剂少,实验成本低,且方法灵敏度与常规的CE方法相比提高了两个数量级,最低定量限达到了250ng/mL,可以用于尿中重组双功能水蛭素浓度的快速测定以及采用尿药法对其人体药物动力学进行测定。对同一志愿者血中和尿中重组双功能水蛭素浓度对比的结果也显示与文献报道的水蛭素主要通过肾脏从尿液排泄相一致。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 人血中重组双功能水蛭素分析方法的研究
• 引言
• 1 液质联用（LC-MS）分析方法的建立
• 2 LC-MS分析方法的验证
• 3 LC-MS分析方法的优化和讨论
• 4 LC-MS分析方法在临床试验中的应用
• 5 本章小结
• 第二章 人尿中重组双功能水蛭素分析方法的研究
• 引言
• 1 毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）分析方法的建立
• 2 CE-MS分析方法的验证
• 3 CE-MS分析方法的优化和讨论
• 4 CE-MS分析方法在临床试验中的应用
• 5 本章小结
• 参考文献
• 综述
• 在校期间发表论文情况
• 申请专利情况
• 致谢