人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用研究

论文摘要

锌指核酸酶是由能够识别并结合特定DNA序列的人工锌指蛋白和一个非特异性核酸内切酶Fok I融合而成的一种人工合成酶,是目前进行高等生物基因组编辑的一个新工具。锌指蛋白与DNA识别的特异性和结合能力是影响ZFN特异性和效率的最关键要素,所以锌指核酸酶技术的核心是锌指蛋白的构建和筛选。本研究以zif268型三锌指为基本框架,利用盒式突变方法,将单个锌指α螺旋中?1, +1, +2, +3, +4, +5和+6位置上的7个关键氨基酸的编码序列分别进行随机突变,获得三个人工三锌指蛋白随机库,建立和完善了应用人工锌指蛋白随机库筛选特异性锌指蛋白的技术平台。然后将得到的DYRK1A特异性锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ连接,构建了DYRK1A锌指核酸酶,应用酵母验证系统测试了DYRK1A锌指核酸酶的特异性和剪切效率。结果如下:1.建立了三个人工锌指蛋白库（人工锌指1库、人工锌指2库和人工锌指3库）。以人DYRK1A基因为例,测试和验证了该技术平台的可行性和效率。利用网上在线查找工具ZiFit 3.2,确定了人DYRK1A基因的靶位点5’-TCGACCACCAGCATCGGCACA- GTGGTGGGCAG-3’,并根据该靶位点设计了一系列报告载体。利用已建立的锌指蛋白库,根据细菌双杂交原理,分别筛选出了结合人DYRK1A基因靶位点中左侧序列和右侧序列的50个三锌指蛋白。2.本实验建立了锌指核酸酶活性的酵母验证系统。将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶Fok I连接,构建成锌指核酸酶表达载体pTrp-ADH1-ZFNL和pLeu-ADH1-ZFNR。根据酵母细胞中断裂双链DNA的修复机制,设计了含有人DYRK1A基因靶序列的报告载体pUra-KanMX4-ZFBS。将该报告载体转入酵母菌JMY31,构建了酵母报告菌株JMY31-DYRK1A。通过对酵母菌落PCR和测序鉴定,含突变KanMX4基因的报告载体在实验组酵母细胞内通过同源重组机制得以修复,修复效率高达90%。测序结果表明,PCR产物为正确的KanMX4基因表达盒,说明突变的KanMX4基因在锌指核酸酶介导下,通过同源重组方式获得准确修复。在酵母细胞内锌指核酸酶活性的验证实验进一步说明了利用细菌双杂交原理,通过开源方式筛选出来的三锌指蛋白对靶位点具有较强的特异性和亲和性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 锌指蛋白结构
• 1.2 人工锌指蛋白转录因子
• 1.2.1 人工设计的转录抑制子
• 1.2.2 人工转录激活子
• 1.3 人工锌指核酸酶
• 1.3.1 ZFN 介导的基因敲除在基础研究中的作用
• 1.3.2 ZFN 介导的基因沉默
• 1.3.3 ZFN 介导的基因同源重组修复
• 1.3.4 脱靶与安全问题
• 1.4 人工锌指蛋白筛选技术
• 1.5 人DYRK1A 基因的研究进展
• 1.5.1 DYRKs 激酶研究进展
• 1.5.2 DYRKs 激酶对RAS 诱导的细胞转化以及E1A 肿瘤抑制作用的影响
• 第二章 人工锌指蛋白随机库的构建与锌指蛋白的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验所需菌种或质粒
• 2.1.2 实验所需工具酶及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因靶位点的选择
• 2.2.2 三锌指蛋白库的构建
• 2.2.3 报告载体和报告菌株的构建
• 2.2.4 有效锌指库的筛选
• 2.2.5 有效锌指库的连接组装
• 2.2.6 高效特异结合单侧靶序列的锌指蛋白的筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人DYRK1A 基因中靶序列的选择
• 2.3.2 三锌指蛋白库的构建
• 2.3.3 有效锌指库筛选
• 2.3.4 有效锌指库的连接组装
• 2.3.5 识别人DYRK1A 基因单侧靶序列的锌指蛋白酶活分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 锌指核酸酶活性的酵母细胞验证
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验所需菌种或质粒
• 3.1.2 实验所需工具酶及试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 含有人DYRK1A 基因靶位点的酵母报告载体和报告菌株的构建
• 3.2.2 ZFN 酵母表达载体的构建
• 3.2.3 ZFN 在酵母细胞中的活性检测
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 结论
• 4.1 研究结论
• 4.2 本研究的创新点
• 4.3 还需深入的研究
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介