黄牛KLF7、KLF11和KLF15基因的单核苷酸多态性及其与生长性状的关联研究

论文摘要

调节能量代谢的基因具有影响家养动物生长的潜力,基因的多态性同样具有此效应。KLF家族（Kruppel-like factors）是真核生物中广泛存在的一类基础转录元件结合蛋白（BTEP）,通过羧基端三个连续锌指构成的保守结构域结合靶基因启动子内富含GC的序列以调控其转录,进而调控各类细胞的增殖分化和组织发育。本研究致力于检测编码KLF转录因子家族中相关基因的单核苷酸多态性（SNPs）,并分析了SNPs与黄牛生长性状的相关性。本研究采用PCR-RFLP、PCR-SSCP和DNA测序技术,检测了南阳牛、秦川牛、郏县红牛和中国荷斯坦牛共4个群体1045个个体的五个与能量代谢调控相关基因（KLF4、KLF5、KLF7、KLF11和KLF15）的遗传变异,分析了其在4个牛群体的遗传结构和遗传多样性,并对四个群体在上述基因位点的单核苷酸多态性与其生长性状进行了相关分析,以检验这些基因对4个黄牛群体生长发育的遗传效应,并对具有显著相关的候选基因进行了实时定量分析,以期发现对重要经济性状具有显著效应的遗传标记,为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。本研究共扫描了五个KLF家族基因（KLF4、KLF5、KLF7、KLF11和KLF15）的17个位点,然而仅在三个基因（KLF7、KLF11和KLF15）的五个位点有多态性,这与KLF转录因子家族在进化中的高保守性和重要功能一致。1. KLF7基因多态性及其与南阳牛、秦川牛和郏县牛生长性状的相关分析本研究揭示了位于KLF7基因第二外显子及其侧翼区的3个SNPs :NC007300:g.41401C>T,42025T>C和42075A>G。其中发现了一个同义突变:苯丙氨酸/苯丙氨酸（p.F54F,C41401T）。有趣的是在同时引入三个TaqI酶切位点后这三个单核苷酸多态性可以同时被酶切和检测。在三个位点中,只有中国荷斯坦奶牛在C41401T位点偏离哈代温伯格平衡状态。连锁不平衡分析发现C41401T和T42025C在郏县红牛中强连锁,T42025C和A42075G在秦川牛、南阳牛和中国荷斯坦奶牛中强连锁（r2 > 0.33）。群体遗传指数分析发现中国荷斯坦奶牛纯合度在C41401T位点达到1,只有一个有效等位基因。χ2检验显示在P1、P2和P3位点基因型分布有显著差异,暗示这些多态性与牛品种显著相关（P<0.001）。关联分析发现在6月龄,T2T2基因型个体（T42025C）的牛比T2C2基因型个体具有更大的日增重（P = 0.009）和胸围（P = 0.009）。在12月龄,C2C2基因型个体（T42025C）比T2C2基因型个体具有更大的体重（P = 0.008）、体长（P = 0.001）和胸围（P = 0.003）;A3A3基因型个体（T42075C）比A3G3基因型个体具有更大的体长（P = 0.006）;单倍型C1C1C2C2A3A3（H1）个体比单倍型C1C1T2C2A3G3（H2）的个体具有更大的体长（P = 0.001）和胸围（P = 0.004）;单倍型C1T1T2C2A3G3（H5）个体比单倍型C1C1T2C2A3G3（H2）的个体具有更大的坐骨端宽（P = 0.007）。KLF7基因的三个单核苷酸多态性P1、P2和P3均与秦川牛和郏县牛的体重和体尺性状没有显著相关。2. KLF11和KLF15基因多态性及其与南阳牛、秦川牛和郏县牛生长性状的相关分析本研究揭示了位于KLF11和KLF15基因的2个SNPs :黄牛KLF11基因NC007309:g.24769 C>T和KLF15基因的NC007301:g.1230 A>G。其中KLF11基因中的C>T突变导致了异亮氨酸>缬氨酸（p.I19V）的错义突变。群体遗传分析发现检测群体中的遗传多样性不高,χ2检验发现KLF11和KLF15位点的基因型分布与黄牛品种显著相关。相关分析结果显示位于KLF11基因3’非翻译区的C/T SNP在南阳牛6月龄的体重（P = 0.002）、日增重（P = 0.006）和体长（P = 0.001）,12月龄的日增重（P = 0.005）效应显著。但KLF15基因的SNP在P < 0.05水平与检测的生长性状没有显示任何相关性。尽管KLF11基因的C/T没有引起氨基酸的改变,但它可能与其它可能还未检测到的SNP或它附近的数量性状基因座（QTL）紧密连锁。KLF11和KLF15基因的两个单核苷酸多态性均与秦川牛和郏县牛的体重和体尺性状没有显著相关。3. KLF7和KLF11基因在秦川牛12个组织的表达谱本试验采集3头18月龄纯种秦川牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、小肠、胃、肌肉、皮下脂肪、腹部脂肪、垂体共12个组织样,采用SYBR Green I荧光染料法检测了KLF7和KLF11基因在秦川牛12个组织的相对表达量。结果显示KLF7基因在胃中表达量最高,在皮下脂肪和腹脂中也有较高的表达量。KLF11基因在胃中的表达量最高,在腹脂、肺、乳腺和皮下脂肪中也有较高表达。脂肪、胃和乳腺均是参与能量代谢的主要器官,提示KLF7和KLF11基因可能在能量代谢中具有重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
• 1.1 基因组技术在家畜育种中的应用
• 1.1.1 动物基因组学的发展
• 1.1.2 动物育种的战略和技术
• 1.2 分子标记概述
• 1.3 分子标记在品种保存研究中的新方向
• 1.4 KLF 基因家族研究进展
• 1.4.1 结构
• 1.4.2 表达、活化和家族内竞争
• 1.4.3 生物学功能
• 1.5 目的意义
• 第二章 黄牛KLF7、KLF11 和KLF15 基因的单核苷酸多态性及其与生长性状的关联分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 资料的统计与分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 牛基因组DNA 样品的检测
• 2.2.2 KLF4 基因单核苷酸多态性的检测
• 2.2.3 KLF5 基因单核苷酸多态性的检测
• 2.2.4 KLF7 基因单核苷酸多态性的检测及其与生长性状的关联分析
• 2.2.5 KLF11 和KLF15 基因单核苷酸多态性的检测及其与生长性状的关联分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 KLF7、KLF11 和KLF15 基因在能量代谢中的重要作用
• 2.3.2 KLF7、KLF11 和KLF15 基因在四个牛群体的遗传特征
• 2.3.3 KLF7、KLF11 和KLF15 基因与黄牛生长性状的相关分析
• 第三章 KLF7 和KLF11 基因的组织表达谱
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 组织总RNA 提取
• 3.1.3 反转录
• 3.1.4 克隆测序
• 3.1.5 实时定量RT-PCR
• 3.2 结果
• 3.2.1 黄牛组织总RNA 的提取与质量检测
• 3.2.2 基因的扩增和检测
• 3.2.3 重组质粒的鉴定
• 3.2.4 定量特异性检测
• 3.2.5 实时荧光定量RT-PCR 分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 KLF7 和KLF11 基因的组织表达谱
• 3.3.2 实时定量PCR
• 结论与创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 3 进一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介