论文摘要
苏云金芽胞杆菌（Bt）在微生物防治害虫的实践中占有极为重要的地位。随着它在防治害虫中的广泛应用,人们对苏云金芽胞杆菌的研究也逐渐发展起来。但是传统Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低、单一制剂大面积反复使用造成害虫产生抗药性等缺点,严重制约Bt的发展与应用。通过现代生物技术手段,分离克隆不同杀虫活性的杀虫晶体蛋白（ICPs）基因,并将不同杀虫活性的ICP基因进行重组,获得杀虫谱广、持效期长、或具有杀虫抗病等多种功能的多样性Bt系列产品。本论文围绕兼治鳞翅目和鞘翅目昆虫的Bt工程菌G033A进行了培养基优化,发酵代谢,增效物质的回收等一系列研究,为加速Bt工程菌的产业化奠定了坚实的基础。主要内容包括:应用响应面分析法（RSM）优化G033A发酵培养基,通过部分因子筛选设计、最陡坡试验、和中心组合设计,并采用多元一次和二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过最少的实验次数,得到一个最优培养基。培养基主要成份为:4 %葡萄糖,4.388 %花生粕;0.391 %酵母抽提物;0.315 %玉米浆粉及微量元素。该培养基作为G033A的发酵培养基,摇瓶发酵水平对棉铃虫的效价为5783IU/μl。RSM法采用合理的实验设计,用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究,可快速获得明确,有目的的结论,为Bt培养基的筛选优化提供了一种新的方法。利用30 L全自动不锈钢发酵罐,进行了G033A分批发酵和补料分批发酵代谢研究。对培养过程各参数的变化、影响发酵因素及外源基因表达需求进行分析,根据G033A不同时空表达启动子的特点,确定了补料浓度、补料时机。采用补料分批发酵工艺,发酵过程控制pH 6.8-7.2,调节转速使溶氧维持在G033A临界氧之上,保持发酵液还原糖水平控制在0.5-1 % ,葡萄糖消耗总量为6.8 %,补加水解植物复合氨基酸共1%,发酵液130 kD /65 kD晶体蛋白含量为0.58 %/0.82 %,增效倍数达5.5倍,发酵液菌数为62亿/ml,发酵液对棉铃虫效价为7012 IU/μl,发酵水平较分批发酵显著提高。研究表明,对一个已经组建完成的工程菌来说,选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。溶氧已成为Bt高密度发酵的主要限制因素,本论文还就搅拌叶类型、温度和罐压对Bt G033A发酵过程的溶氧影响进行了研究,如下组搅拌叶用平叶,中组搅拌用箭叶和弯叶时,充分混合可有效改善供氧;在工程菌Bt G033A发酵过程中,温度每下降0.1℃,溶氧升高约1%;罐压从0.05 MPa提高到0.065MPa,溶氧浓度平均增加12%左右,发酵过程应合理控制对数期的温度和罐压来提高溶氧。这些研究工作对于指导G033A生时如何有效控制发酵过程溶氧高于临界之上具有指导和实践意义。G033A高产Zwittermicin A,本课题建立了离子交换树脂的方法回收G033A发酵上清液中Zwittermicin A的工艺,采用该工艺增效物质回收率达93.1%,增效粉单位达463U/g。研究表明,离交工艺回收G033A发酵上清液中的增效物质是一种可行的,具有工业应用价值的方式,能得高质量的Zwittermicin A,将其与晶体进行科学配伍,获得性状好,效价高的Bt产品。
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标签：工程菌论文; 响应面分析法论文; 发酵代谢研究论文; 增效物质回收工艺论文;