稳定表达EGFR细胞系的建立及其抗EGFR单链抗体的筛选与鉴定

论文摘要

第一部分稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立目的建立膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系，为后续研究奠定基础。方法采用CaCl2法将pEGFR-EGFP质粒转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞；以EGFP作为荧光报告分子，克隆化培养以获取单克隆阳性细胞；流式细胞术、荧光显微镜术、Western Blot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达；反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。结果①转染后，经G418筛选14天，克隆化培养，共获得2株稳定转染的单克隆细胞，分别命名为CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2；②经流式细胞仪检测，CHO-EGFR-GFP1细胞GFP、PE双标记阳性率达92％以上，说明EGFR-GFP融合蛋白主要表达于细胞膜上，CHO-EGFR-GFP2细胞GFP检测阳性率较高，但PE标记阳性率较低，提示融合蛋白主要表达于细胞内；③倒置相差荧光显微镜观察可见CHO-EGFR-EGFP1主要表现为细胞膜绿色荧光，能与PE标记的anti-human-EGFR结合，CHO-EGFR-EGFP2细胞主要呈现细胞内绿色荧光，不与PE标记的anti-human-EGFR结合，与流式细胞仪检测结果一致；④Western blot分析CHO-EGFR-GFP1细胞裂解液可见分子量约166 kDa条带；⑤CHO-EGFR-EGFP1细胞经反复冻存、复苏，证明EGFR-GFP融合蛋白能稳定表达，表明成功建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系，为研究EGFR与其配体间相互作用以及筛选靶向EGFR的单链抗体奠定了基础。第二部分EGF对CHO-EGFR-GFP1细胞生物学特性的影响目的对于大多数细胞而言，EGFR与其配体EGF相互作用往往促进其增殖，但对于某些细胞，EGF且相反地抑制其增殖。本部分研究拟以所建立的膜表面表达全长EGFR与GFP融合蛋白的细胞系CHO-EGFR-GFP1为模型，进一步研究EGF与EGFR之间相互作用。方法通过细胞计数，绘制生长曲线，比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长情况；台盼蓝染色计数活细胞数观察不同浓度EGF刺激48h后细胞增殖情况；PI染色一步法流式细胞仪检测不同浓度EGF刺激48h和100ng／ml EGF刺激不同时间细胞周期改变以及细胞凋亡情况，Hoechst 33258染色观察细胞凋亡情况；流式细胞术测定GFP平均荧光强度、Western blot检测及倒置荧光显微镜观察判定EGFR表达水平的变化。结果以建立的膜表面表达全长EGFR与GFP融合蛋白的细胞系CHO-EGFR-GFP1为细胞模型，研究EGF与EGFR之间的相互作用。研究结果表明：①在不加入EGF的培养体系中，CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2细胞与未转染CHO-K1细胞生长特性无显著差异，在保证培养条件、接种细胞数、观察时间基本一致的情况下，各细胞增殖速度接近，说明表达的融合蛋白对细胞没有明显毒性；②在培养体系中，加入低浓度的EGF可促进CHO-EGFR-GFP1细胞增殖，而在高浓度EGF培养体系中则引起CHO-EGFR-GFP1细胞失去粘附、细胞周期阻滞、促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖；③EGF对细胞增殖的影响与EGFR表达水平密切相关，高浓度EGF以一种剂量依赖性的方式同时上调EGFR的表达和引起细胞凋亡；④EGF刺激对CHO-K1及CHO-EGFR-GFP2细胞生长无明显作用。第三部分EGFR特异性内吞性单链抗体的筛选与鉴定目的利用抗体将治疗分子（毒素、治疗基因）直接运送到肿瘤细胞内发挥作用是一种重要的肿瘤靶向治疗策略。本研究拟从大型人源抗体库Griffin 1中直接筛选出靶向EGFR并能够触发其内吞的单链抗体，为研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定基础。方法以稳定转染的CHO-EGFR-GFP1细胞和未转染的CHO-K1细胞分别作为阳性和阴性细胞，采用负筛选的方法，洗去与细胞表面结合的噬菌体，裂解细胞获取内吞性的噬菌体用于下一轮筛选；通过比较每轮投入及洗脱出噬菌体的效价比以及细胞ELISA检测多克隆p-scFv与阳性、阴性细胞结合情况对筛选过程进行监测；采用菌落PCR挑选含有全长scFv片断的菌落，进一步用FCM检测单克隆p-scFv与天然表达EGFR细胞及EGFR阴性细胞结合情况；挑选EGFR特异性单克隆p-scFv采用DNA测序法确定克隆多样性；原核表达EGFR特异性s-scFv采用FCM检测其与天然表达EGFR细胞及EGFR阴性细胞结合百分率，采用Western blot检测其与EGFR阳性细胞及阴性细胞裂解液结合的差异，倒置荧光显微镜观察s-scFv是否被内吞入EGFR阳性细胞。结果经过5轮筛选，细胞裂解液中洗脱出噬菌体效价有500倍以上提高，而细胞表面结合噬菌体效价仅有15倍增长，说明内吞性p-scFv得到富集；细胞ELISA结果显示多克隆p-scFv与CHO-EGFR-GFP1细胞和CHO-K1细胞均有明显结合，但与前者结合高于后者，说明所获多克隆p-scFv大多数针对两种细胞表面共同抗原，但有部分特异性结合EGFR；菌落PCR显示约45％克隆中含有完整的1kb scFv片断；共挑取300个菌落，经菌落PCR、细胞ELISA、FCM检测，共得到4株EGFR特异性scFv，DNA测序结果显示4株DNA序列仅一株有个别碱基不同，但均能翻译成同样的氨基酸系列，因此将其统一命名为F4-scFv，F4-scFv可与天然表达EGFR的细胞特异性结合并能触发受体介导的内吞作用，但不与EGFR阴性细胞结合；Western blot检测F4-scFv可识别EGFR特异性条带。F4-scFv可被用作载体运送治疗药物进入肿瘤细胞，而且由于其人源性，对人将无免疫原性。在筛选和鉴定过程中采用表达GFP标记的受体的转染细胞作为阳性细胞，不用表达、纯化受体蛋白用于筛选和检测，可保证所筛选的抗体能与天然受体结合，加快了获取靶向抗体的进程。结论成功建立膜表面稳定表达EGFR-GFP的细胞系CHO-EGFR-GFP1；首次在同一种因不同浓度EGF刺激而表达不同水平EGFR的细胞中观察到EGF对细胞增殖的影响与EGFR表达水平的关系。高浓度EGF刺激引起肿瘤细胞失去粘附可能是导致肿瘤细胞容易脱落，发生转移的机制之一；进一步以CHO-EGFR-GFP1为阳性细胞，未转染CHO-K1细胞为阴性细胞，采用负筛选方法，从大型人源抗体库中筛选得到EGFR特异性能够触发受体内吞的单链抗体F4-scFv，F4-scFv可用于运载治疗性物质进入高表达EGFR的肿瘤细胞，为进一步研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定了基础。

论文目录

• 缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• Part Ⅱ Effect of epidermal growth factor （EGF） on the biological characters of CHO-EGFR-GFP1 cells
• Introduction
• Materials and methods
• Results
• Discussion
• References
• Part Ⅲ Selection and characterization of an internalizing epidermal growth factor receptor antibody
• Introduction
• Materials and methods
• Results
• Discussion
• 附录一
• 附录二
• References
• 小结
• 研究结果
• 特色与创新
• 有待解决和进一步研究的问题
• 综述 表皮生长因子受体与肿瘤生物治疗
• 博士期间发表文章
• 致谢