PPARγ在人胶质瘤细胞SWO-38中诱导分化作用机制的研究

论文摘要

目的:了解PPARγ蛋白在人胶质瘤组织和细胞株中的表达,观察CDA-2对人胶质瘤细胞SWO-38 PPARγ蛋白表达的影响和对SWO-38细胞的诱导分化作用,并进一步探讨PPARγ在胶质瘤诱导分化中的作用机制,为胶质瘤诱导分化治疗提供治疗靶点,同时也为发展新的分化诱导剂提供靶标和科学依据。方法:1.应用免疫组化检测40例胶质瘤组织中PPARγ蛋白表达;RT-PCR和western blot检测人胶质瘤细胞SWO-38、U251和SHG-44中PPARγmRNA和蛋白表达;western blot检测三株胶质瘤细胞GFAP蛋白表达。2. Western blot检测罗格列酮、ATRA和CDA-2在不同剂量和不同作用时间对SWO-38细胞PPARγ蛋白表达的影响;RT-PCR进一步了解CDA-2对SWO-38细胞PPARγmRNA表达的调节;免疫组化CDA-2对PPARγ蛋白亚细胞定位的影响。3. MTT、集落形成实验检测CDA-2对SWO-38细胞活性及增殖能力的影响;FCM进一步了解CDA-2对SWO-38细胞周期的影响;HE染色、免疫组化和western blot从细胞形态和GFAP蛋白表达等方面检测CDA-2对SWO-38细胞的诱导分化作用。4. PPARγ抑制剂GW9662预处理细胞后,通过MTT、集落形成实验、FCM和western blot等方法检测SWO-38细胞在细胞活性、增殖能力、细胞周期和GFAP蛋白表达等方面的变化,了解CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ之间的关系。同时,western blot检测CDA-2诱导SWO-38细胞分化过程中PTEN（p-PTEN）和COX-2蛋白的表达; GW9662预处理细胞阻断PPARγ活化,western blot进一步检测SWO-38细胞PTEN（p-PTEN）和COX-2蛋白在对照组（ DMSO+CDA-2 ）和抑制剂组（GW9662+CDA-2）的表达,探讨PPARγ在CDA-2诱导SWO-38细胞分化中的作用机制。结果:1. PPARγ在胶质瘤组织中阳性表达率仅为37.5%,在瘤旁脑组织中的阳性表达率为76.9%,二者间差异有显著意义（p<0.05）;PPARγ表达与胶质瘤分化程度无明显相关性（p>0.05）;PPARγmRNA和蛋白在SWO-38和U251细胞均有中表达,而SHG-44细胞中无表达;GFAP蛋白在SHG-44细胞中表达明显高于SWO-38和U251细胞（p<0.05）。2. Western blot结果提示罗格列酮、ATRA和CDA-2均可促进SWO-38细胞PPARγ蛋白表达,CDA-2 3mg/ml作用3 h即可明显促进细胞PPARγ蛋白表达;RT-PCR结果则表明CDA-2可促进SWO-38细胞PPARγmRNA表达;免疫组化检测结果显示对照组PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中均有表达,CDA-2处理组PPARγ蛋白主要表达于胞核,即PPARγ蛋白出现核转位。3. MTT和集落形成实验结果提示CDA-2抑制SWO-38细胞活性和增殖能力,中效抑制浓度（IC50）分别为2.33±0.37 mg/ml和0.51±0.01 mg/ml,其抑制作用呈时间和剂量依赖性增强;细胞周期检测提示在CDA-2作用下,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,提示G1期阻滞;HE染色结果显示CDA-2 3 mg/ml作用72 h后SWO-38细胞胞体增大,核/浆比例减小,细胞突起增多变长;免疫组化和western blot显示细胞GFAP蛋白表达增强,瘤细胞表现出向成熟胶质细胞分化表型。4. PPARγ抑制剂GW9662预处理SWO-38细胞后,与对照组（DMSO+CDA-2组）相比,MTT结果显示抑制剂组CDA-2对细胞的抑制作用减弱,二者的IC50分别为2.46±0.16 mg/ml及1.79±0.18 mg/ml（p<0.05）;集落形成实验结果显示抑制剂组CDA-2对细胞克隆形成的抑制作用下降（p<0.05）;FCM显示抑制剂组S期细胞增多（p<0.05）;western blot结果提示抑制剂组GFAP蛋白表达较对照组明显下降（p<0.05）,提示CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ有关。同时,western blot结果亦表明CDA-2可促进SWO-38细胞PTEN（p-PTEN）蛋白表达而抑制COX-2蛋白表达;Western blot进一步证实CDA-2对SWO-38细胞PTEN（p-PTEN）和COX-2蛋白表达的调控作用可部分被GW9662逆转,提示CDA-2对SWO-38细胞PTEN（p-PTEN）和COX-2蛋白的调控作用与PPARγ有关。结论:1. PPARγ与胶质瘤的发生相关,可为胶质瘤治疗提供新的靶点。2. CDA-2可上调SWO-38细胞中PPARγ蛋白表达,同时促进其核转位,提示CDA-2可活化PPARγ蛋白。3. CDA-2在体外实验中显示对SWO-38细胞的增殖抑制和周期阻滞作用;同时,CDA-2诱导SWO-38细胞趋于成熟分化,是一种良好的诱导分化剂。4. CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ信号通路有关。PPARγ通过对PTEN（p-PTEN）、COX-2和GFAP等基因表达的调控参与胶质瘤的诱导分化。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：PPARγ在人胶质瘤细胞SWO-38 中诱导分化作用机制的研究
• 前言
• 第一部分：PPARγ在胶质瘤中的表达及意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分：罗格列酮、ATRA 和CDA-2 促进胶质瘤细胞SWO-38 PPARγ表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第三部分：CDA-2 诱导人胶质瘤细胞SWO-38 分化并抑制其增殖的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第四部分：PPARγ诱导人脑胶质瘤细胞SWO-38 分化的机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 全文总结
• 本课题的创新点
• 存在的问题和展望
• 文献综述一
• 文献综述二
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文和标书撰写