PRRSV GP5蛋白与泛素融合蛋白基因重组质粒的构建与免疫特性研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是目前危害养猪业重要的病原之一。GP5蛋白是该病毒的主要保护性抗原,含有中和性抗原表位,但猪感染PRRSV后产生中和抗体的时间较晚,而且其滴度较低。泛素（Ubiquitin,简称Ub）是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的小蛋白质。泛素依赖性的蛋白质降解途径是目前已知的重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径之一。Ub可用于增强DNA疫苗免疫反应。我们假设PRRSV保护性免疫力较低可能与糖基化蛋白中和抗原表位空间结构有关,所以,本研究将Ub基因插入GP5基因5端,旨在有效的将糖基化蛋白分解成小的多肽,促进不同抗原表位提呈,增强免疫效果,为PRRSV DNA疫苗提供理论依据。 根据GenBank数据库中的PRRSV S1毒株GP5基因序列设计合成了两对分别含有Bg/Ⅱ、NotI酶切位点的引物,以pcDNA3-ORF5质粒为模板用PCR技术获得大小为620bp左右的目的产物,经纯化后与真核表达载体pCMV-Ub同时进行酶切,分别经回收后连接。连接产物转化DH5α感受态细菌,然后在氨苄青霉素抗性（AmpR）平板上挑取阳性菌落,过夜培养,提取质粒,经单酶切、双酶切鉴定及DNA序列测定。用DNAStar软件分析结果表明:扩增片段与预期片段大小相符,且完全符合载体阅读框。该毒株GP5基因序列与美洲标准毒株和其它分离株的基因同源性为99%。最后分别命名为pCMV-Ub-GP5、pCMV-GP5。 用PEG2000提取纯化了重组质粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5,将重组质粒组以100μg背部皮内注射免疫BALB/c小鼠,以间隔15天的频率共免疫4次,用中和抗体试验和ELISA试验测定不同时间小鼠血清PRRSV抗体,以比较GP5基因和与泛素融合表达GP5基因的免疫特性。结果表明,第三次免疫后14天（即首免后44天）pcMV-ub-GP5和pcMV-GP5免疫组的小鼠血清ELISA试验OD490值均能达到1.0,且均可检测到中和抗体的存在,在第4次免疫后14d（即首免后59d）中和抗体平均涌厦为7和12,抗体产生时间和抗体滴度差异不显著。 以上研究结果表明,本文成功构建了PRRSV GP5蛋白和泛素融合蛋白基因重组质粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5。重组质粒DNA免疫小鼠都能诱导产生抗PRRSV的特异性体液免疫应答,两者无显著差异,本试验泛素化的GP5的细胞免疫特性有待进一

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 PRRSV免疫及主要结构蛋白免疫特性
• 1 PRRSV主要结构蛋白免疫特性
• 2 对PRRSV感染的免疫应答
• 参考文献
• 第二章 核酸疫苗免疫增强途径
• 1 核酸疫苗免疫学基础
• 2 核酸疫苗免疫增强途径
• 参考文献
• 第三章 PRRSV GP5蛋白与泛素融合蛋白基因重组质粒的构建及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 PCR扩增GP5基因
• 2.2 目的基因的克隆与重组质粒的鉴定
• 2.3 DNA序列测定与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 PRRSV GP5与泛素融合蛋白基因重组质粒小鼠免疫特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 中和抗体的检测
• 2.2 ELISA抗体的检测
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 英文摘要
• 全文总结
• 致谢
• 附录