论文摘要
黑色素瘤分化相关基因-7（mda-7,又称IL-24）是1995年采用减数杂交技术在诱导终末分化的人黑色素瘤细胞HO-1中发现的新基因。mda-7/IL-24在很多实体肿瘤（包括黑色素瘤、前列腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性神经胶质细胞瘤等）中异位表达时具有肿瘤细胞特异性抑制生长和诱导凋亡作用;此外,还可以抑制肿瘤血管新生、具有抗肿瘤“旁观者效应”以及能够增强肿瘤细胞对射线的敏感性。研究发现mda-7/IL-24在实体瘤中的抗肿瘤作用机制是多种多样的,而对造血系统恶性肿瘤的作用还不清楚。我们在前期工作中,在诱导白血病细胞系U937、HL60向单核-巨噬细胞分化后发现有mda-7/IL-24及mda-7/IL-24选择性剪接体IL-24as1的表达。mda-7/IL-24及IL-24as1在HL-60、U937白血病中的作用,与白血病细胞分化的关系尚无文献报道。为了探索mda-7/IL-24、IL-24as1以及二者同时存在情况下对HL-60、U937的作用,我们构建了mda-7/IL-24、剪接体IL-24as1、IL-24和IL-24as1共表达的真核表达载体pIRES-IL-24、pIRES-IL-24as1、pIRES-IL-24-IL-24as1,通过电穿孔法瞬时转染人白血病细胞系U937、HL60,经confocol和Western blot方法鉴定转染效率及目的基因的表达情况。通过生长曲线、集落形成实验、FACS和动物实验来评价mda-7/IL-24、剪接体IL-24as1以及IL-24-IL-24as1对肿瘤细胞增殖、集落形成能力、凋亡情况、体内致瘤性变化的影响来评价mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1对HL-60、U937的抗肿瘤作用,并且通过形态学染色和细胞表面单核巨噬系分化标志分子CD11b、CD14、M-CSFR的检测来评价其对单核巨噬系分化的影响。结果发现,与转染空载体对照组相比,瞬时转染48h、72h,HL-60、U937细胞均出现mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1蛋白表达,72h达到高峰期。瞬时表达mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1的细胞生长状态、细胞增殖活力以及集落形成能力与对照组相比明显下降（p＜0.05）,凋亡率与对照比明显升高（p＜0.05）,其中IL-24as1抑制肿瘤细胞生长作用较强,而IL-24的促凋亡能力较强。裸鼠体内肿瘤形成实验进一步证实了mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1的抗肿瘤作用。细胞分化相关实验结果证实,与对照组相比,mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1具有明显促进U937、HL60向单核巨噬系分化能力（P＜0.05）,CD11b、CD14、M-CSFR表达明显升高,其中IL-24as1的促分化作用较强。上述结果表明,mda-7/IL-24、剪接体IL-24as1、IL-24-IL-24as1均有抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞分化成熟的作用,其中剪接体IL-24as1的促分化作用较强,IL-24的促凋亡作用较强。尽管HL-60、U937在用诱导剂诱导分化后可以同时出现mda-7/IL-24及IL-24as1的表达,但将mda-7/IL-24及其剪接体IL-24as1同时异位转染到白血病细胞,并不能使抑制生长、诱导凋亡、诱导分化作用较单独基因转染更强,可能二者之间不存在协同作用方式。为了进一步证实mda-7/IL-24、剪接体IL-24as1、IL-24-IL-24as1对白血病细胞的诱导分化作用,我们又通过电穿孔方法将特异性针对于mda-7/IL-24和IL-24as1基因的干扰片断siRNA瞬时转染到U937、HL60细胞系中,同时加入TPA诱导mda-7/IL-24和IL-24as1的表达。通过形态学染色和检测细胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表达来评价siRNA对mda-7/IL-24和IL-24as1基因表达的干扰是否影响诱导剂对HL-60、U937的诱导分化作用。Western blot测定干扰效率可达80%。形态学及分化相关分子表达均证实,siRNA干扰mda-7/IL-24以及IL-24as1的表达,会使诱导剂失去对U937、HL60细胞向单核巨噬系诱导分化作用。以上结果进一步表明mda-7/IL-24和IL-24as1与U937、HL60细胞的单核巨噬系分化密切相关。为了进一步检测mda-7/IL-24以及IL-24as1能否诱导单核细胞白血病病人骨髓幼稚细胞分化和凋亡,我们收集了3例M5型白血病病人骨髓单个核细胞,通过电穿孔方法瞬时转染pIRES-IL-24、pIRES-IL-24as1以及pIRES-IL-24-IL-24as1,72h后通过FACS检测细胞表面CD11b、CD14、M-CSFR的表达、凋亡的变化以及进行细胞形态学染色。结果发现瞬时转染pIRES-IL-24、pIRES-IL-24as1、plRES-IL-24-IL-24as1的细胞与转染空载体的细胞相比,有明显的促进病人细胞分化成熟的作用,CD11b、CD14、M-CSFR指标各有不同程度的升高。形态学染色亦表明IL-24as1、IL-24、IL-24-IL-24as1具有促病人BMMC向成熟阶段分化的作用。凋亡检测表明瞬时转染pIRES-IL-24、pIRES-IL-24as1以及pIRES-IL-24-IL-24as1对两例病人有明显的促凋亡作用。我们的工作首次证明,异位表达的mda-7/IL-24、IL-24as1、IL-24-IL-24as1可抑制造血系统恶性肿瘤细胞HL-60、U937,并能促进单核系幼稚肿瘤细胞向成熟阶段分化。
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