牛胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性作用的研究

论文摘要

胰岛素是胰脏中胰岛β细胞分泌的一种相对分子质量较小的蛋白质激素,它的主要功能是降低体内血糖含量,因此临床上常用于治疗糖尿病。但是胰岛素药物在生产、运输、储存利临床应用中常常会形成淀粉样蛋白聚集,这些淀粉样聚集体可能具有免疫原性和其他副作用,从而影响其疗效。本实验室前期的研究表明,20种常见氨基酸对牛胰岛素蛋白具有一定的稳定作用。本研究筛选出五种具有代表性的氨基酸,研究其对胰岛素纤维化的抑制作用机理。此外,为进一步探索胰岛素淀粉样纤维的形成动力学机制,纤维化过程中的蛋白结构改变,以及不同纤维形态的生物效应,我们采用人红细胞为体外实验模型,对胰岛素淀粉样纤维的细胞毒性作用进行了分析,并通过对细胞膜胆固醇修饰,研究不同细胞膜脂质组成与淀粉样纤维毒性作用的关系,同时与淀粉样肽Aβ25-35的细胞毒性作用进行比较。实验结果表明,氨基酸对胰岛素淀粉样纤维的形成有延迟作用,延迟作用的不同可导致不同的纤维形态,Arg的延迟作用最强;胰岛素纤维对红细胞有溶血作用,这种作用与纤维的形态无关,其溶血机制与Aβ25-35也不一样。本研究揭示了蛋白质或多肽淀粉样纤维的细胞毒性与纤维形态无关,而与蛋白在自组装过程中形成的β折叠结构有关,也与细胞膜的脂质构成密切相关。实验主要方法和结论:一、氨基酸对胰岛素淀粉样纤维形成的抑制作用1.胰岛素淀粉样纤维形成过程的ThT荧光及电泳分析牛胰岛素在pH1.6,57℃的条件下,可在2 h左右开始形成淀粉样纤维。ThT荧光曲线与纤维的生长过程相一致,该过程主要包括三个阶段:成核,生长和纤维形成阶段。通过ThT荧光测定、蛋白纤维的巯基测定及聚丙烯酰胺凝胶电泳等实验技术,研究了在氨基酸存在的条件下,胰岛素淀粉样纤维形成的动力学机制。2.氨基酸对胰岛素淀粉样纤维形成具有抑制作用ThT荧光结果表明加入氨基酸有效地延迟了纤维的生长,并且不同氨基酸的延迟作用各不相同。在我们所选的五种氨基酸中His延迟时间最短,之后依次是Pro、Thr和Gin,延迟作用最强的是Arg,这可能与Arg具有分子伴侣作用,能够促进蛋白分子折叠的作用有关。3.氨基酸对胰岛素淀粉样纤维的形貌影响在氨基酸的作用下,胰岛素淀粉样纤维的形态发生了一定程度的改变。透射电镜结果显示,加His后与不加任何氨基酸处理的胰岛素纤维形态相似,都是中空结构,但加His后形成的纤维较短并聚集成束状;加Pro、Thr和Gin处理形成的纤维之间的形态相似,无中空的束状纤维结构;而加Arg处理后观察明显的纤维状聚集。4.氨基酸对胰岛素淀粉样纤维形成过程中巯基生成的影响在胰岛素纤维化过程中对可能生成的的巯基进行检测,结果表明胰岛素纤维化涉及二硫键断裂而产生自由巯基,该反应与纤维生长的过程一致。加入氨基酸后,自由巯基生成有所延迟.但Arg处理后不能抑制巯基生成,与其抑制纤维生成的作用并不相关。由此可推测Arg仅是抑制蛋白纤维的形成而并不抑制蛋白去折叠或是形成中间体状态。二、胰岛素淀粉样纤维的细胞毒性作用1.胰岛素淀粉样纤维导致红细胞聚集作用和溶血作用采用人红细胞为实验模型,研究了胰岛素淀粉样纤维的细胞毒性作用。结果表明低浓度的胰岛素淀粉样纤维能够导致红细胞聚集,而高浓度的纤维能够导致红细胞溶血。几种纤维对细胞的作用大致相同,其形态上的差别并没有使其细胞毒性发生变化。2.胆固醇修饰后胰岛素淀粉样纤维与Aβ（25-35）的细胞毒性作用差异胰岛素淀粉样纤维的细胞毒性与细胞膜的脂质构成密切相关。将红细胞经胆固醇修饰后,再用胰岛素淀粉样纤维和Aβ（25-35）相互作用,结果显示:采用Aβ（25-35）处理时,去胆固醇对红细胞有保护作用,加胆固醇反而有促进红细胞溶血作用。与此相反,胰岛素淀粉样纤维处理时去胆固醇促进红细胞溶血作用,加胆固醇有保护作用。这可能源于两者具有不同的分子量和一级序列,从而导致完全不同的细胞毒性机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 蛋白质的作用及其不稳定性
• 1.2 蛋白质折叠
• 1.3 多肽淀粉样病变的简介
• 1.3.1 淀粉样肽的发现和形成
• 1.3.2 淀粉样肽相关疾病
• 1.4 胰岛素及其形成胰岛素纤维研究简介
• 1.4.1 胰岛素的发现及序列测定
• 1.4.2 胰岛素的结构特点及序列
• 1.4.3 胰岛素的生理功能
• 1.4.4 胰岛素淀粉样聚集的研究
• 1.5 β淀粉样肽
• 1.5.1 β淀粉样肽与阿尔兹海默疾病
• 1.5.2 β淀粉样肽的来源及其毒性
• 1.6 红细胞的结构和功能
• 1.7 氨基酸在淀粉样变性的研究中的作用
• 1.8 结束语
• 第2章 实验部分
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料和药品
• 2.1.2 溶液及配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 红细胞的分离
• 2.3.2 胰岛素蛋白纤维孵育方法
• 2.3.3 纤维生长曲线
• 2.3.4 纤维形态观察
• 2.3.5 纤维生长不同时期的电泳检测
• 2.3.6 纤维导致红细胞的溶血检测
• 2.3.7 红细胞聚集观察
• 2.3.8 巯基检测
• 2.3.9 内源荧光检测
• 2.3.10 胆固醇修饰
• 2.4 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 纤维生长曲线
• 3.2 胰岛素纤维的形态
• 3.3 胰岛素纤维的溶血活性和诱导红细胞聚集的作用
• 3.4 不同生长时期纤维电泳
• 3.5 巯基测定结果
• 3.5.1 标准曲线
• 3.5.2 加入不同氨基酸后牛胰岛素蛋白纤维的巯基定量
• 3.6 内源荧光测定结果
• 25-35对胆固醇修饰后的红细胞的影响'>3.7 胰岛素纤维与Aβ_25-35对胆固醇修饰后的红细胞的影响
• 25-35的影响'>3.7.1 胆固醇修饰后Aβ_25-35的影响
• 3.7.2 胆固醇修饰后胰岛素纤维的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 胰岛素纤维化的机制
• 4.2 氨基酸对胰岛素成纤维的抑制作用
• 4.3 胰岛素纤维对红细胞的毒性作用
• 4.4 胆固醇对淀粉样纤维毒性作用的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果