论文摘要
研究背景和目的原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）简称肝癌,是一种严重影响人类健康的恶性肿瘤,在我国每年肝癌的发病率为20.37/10万,其死亡率高居癌症死亡率的第二位。目前,临床上可用于治疗肝癌的手段虽然比较多,包括手术、肝移植、血管介入、消融技术、放化疗等,但临床上有一半以上的肝癌患者在行根治性手术前已有了无法检测出的微小转移,它是肝癌术后转移和复发的直接原因。因此,预测肿瘤转移倾向、判断肿瘤预后的标志物,寻找预防和治疗的有效途径,提高病人的5年生存率,降低死亡率是肝癌研究的重点内容,也是肿瘤防治研究中的一个重点和难点。Tiaml（T lymphoma invasion and metastasis 1,T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1）基因是鸟苷酸转换因子（guanine nucleotide exchange factors,GEFs）家族成员。GEFs的主要功能是调节Rho GTPase的活性。Rho GTPase家族包括Rho、Rac及Cdc42,是Ras超家族的成员。Tiam1基因体内外均可以特异性地激活RhoGTPase家族中的Rac1。新近的研究发现Tiam1不但激活Rac,更重要的是Tiam1可直接与胞浆和胞膜上的蛋白质相互作用,将它们耦合到Tiam1-Rac信号通路上,从而影响Rac信号通路的特异性。Tiam1基因最初在小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离鉴定。随后,在乳腺癌、肺癌及Ras诱导的皮肤癌等肿瘤中证实Tiam1具有明显的促进肿瘤演进和转移的作用。在Tiam1敲除的动物模型中,小鼠皮肤癌发生率明显减低并且肿瘤演进缓慢,Malliri等认为Tiam1在Ras诱导皮肤癌发生的启动和进展阶段发挥关键作用,这一效应与Tiam1表达量有明显的关系。上述的研究表明,Tiam1是多种肿瘤的促癌基因和促进转移基因。本研究拟应用自行设计的包括部分常见恶性肿瘤组织和正常组织的组织芯片,采用免疫组化方法检测和观察人体正常组织和常见恶性肿瘤组织,152例肝癌组织和8种人肝癌细胞株及1种人正常肝细胞株Tiam1蛋白的表达情况;分析Tiam1蛋白在肝癌中的表达及其与各临床病理参数之间的关系,同时结合临床随访资料回顾性分析Tiam1蛋白表达与肝癌患者生存期的关系,寻找提高肝癌预后评价敏感性和特异性的方法;利用基因沉默技术初步研究Tiam1基因在肝癌增殖、侵袭中的作用,探讨Tiam1作为肝癌分子靶点的可行性;为肝癌患者的诊断、预后评价、综合治疗方案设计提供有力的理论依据。方法1、Tiam1蛋白在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织的分布和表达研究自行设计并制作了包括鼻咽癌、肺鳞癌、肺腺癌、食道鳞癌、食道腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肾透明细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱移行上皮癌、脑胶质瘤、皮肤鳞状细胞癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤等19种恶性肿瘤及鼻咽、肺、食道、胃、结肠、直肠、纤维平滑肌、肝、胰腺、乳腺、膀胱、子宫颈、卵巢、肾、前列腺、淋巴结、皮肤、脑等18种正常组织的组织芯片,结合免疫组化方法检测Tiam1蛋白在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织的分布和表达。2、Tiam1基因/蛋白在人正常肝细胞和肝癌细胞中的表达研究应用荧光定量PCR、免疫细胞化学、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测HepG2、Hep3B、SMMC-7721、QGy-7701、QGy-7703、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405等8种肝癌细胞株和人正常肝细胞株HL-7702中的Tiam1基因/蛋白的表达情况。3、Tiam1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义应用免疫组化EnVisionTM二步法检测Tiam1蛋白在152例肝癌组织中的表达情况;应用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用x2检验分析Tiam1蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系;采用Kaplan-Meier法回顾性分析Tiam1蛋白表达与肝癌患者生存期的关系;以COX回归对各项指标单因素或多变量联合与生存期的关系进行统计学分析。4、Tiam1基因表达沉默对肝癌细胞生物学特性的影响利用在线数据库和软件设计Tiam1基因干扰片段,用含Tiam1基因的干扰片段瞬时转染肝癌细胞株QGy-7701细胞,荧光定量PCR和Western blot检测Tiam1基因干扰效率。利用MTT法及流式细胞术检测Tiam1基因沉默后对细胞体外增殖的影响;利用体外侵袭小室进行体外侵袭实验,检测Tiam1基因沉默后对肝癌侵袭能力的影响。结果1、Tiam1蛋白在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织中的分布和表达情况Tiam1蛋白在正常组织中的乳腺纤维组织、胰腺、肝组织未见阳性表达,而在鼻咽、肺、食道、胃、结肠、直肠、纤维平滑肌、膀胱、子宫颈、卵巢、肾、前列腺、淋巴结、皮肤、脑等15种正常组织中可见不同程度的Tiam1蛋白阳性表达。其中在前列腺增生组织腺上皮、增生平滑肌组织、肾脏远曲小管上皮细胞、血管壁平滑肌等组织中可见Tiam1蛋白中到高表达。Tiam1蛋白在鼻咽癌、乳腺癌、肺鳞癌、肺腺癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤等10种肿瘤组织中高表达;在食道鳞癌、食道腺癌、胃癌、胰腺癌、肾透明细胞癌、宫颈癌、膀胱移行上皮癌、脑胶质瘤、皮肤鳞状细胞癌等9种肿瘤组织中可见Tiam1蛋白低表达。此外,我们还发现肝癌癌旁肝硬化组织和伴有纤维组织明显增生的肝组织中也可见Tiam1蛋白低到中度表达,但表达强度明显弱于肝癌组织,且范围小于肝癌组织。2、Tiam1基因在肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达情况采用荧光定量PCR法检测8种人肝癌细胞株和1种人正常肝细胞株中Tiam1基因的表达情况。单因素方差分析的结果表明:9种细胞株中Tiam1基因的表达差异具有显著性（F=80.514,P＜0.001）,Tiam1基因在8种肝癌细胞中的表达水平均明显高于正常肝细胞中的表达水平,差异具有统计学意义。3、Tiam1蛋白在肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达情况免疫细胞化学检测结果显示,Tiam1蛋白在正常肝细胞株中不表达,在肝癌细胞株中阳性表达。Western blot及细胞免疫荧光检测结果与免疫细胞化学结果一致。4、Tiam1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义免疫组化检测结果显示Tiam1蛋白在152例肝癌组织中的总阳性表达率为88.1%,而在正常组织中呈阴性表达。肝癌组织中各级表达所占比例分别为:“-”占11.9%（18/152）,“+”占24.3%（37/152）,“++”占39.5%（60/152）,“+++”占24.3%（37/152）。Tiam1蛋白表达与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肝硬化、转移、复发、血清HBsAg、血清AFP均无相关性（P＞0.05）。随访发现,Tiam1蛋白高表达肝癌患者中位生存时间为27.0个月,低于Tiam1蛋白低表达患者中位生存时间60.0个月,Tiam1高表达患者与低表达患者生存时间有显著性差异（P=0.008＜0.05）。将Tiam1蛋白表达和临床病理参数综合与肝癌患者的生存时间进行单因素分析,结果显示Tiam1蛋白高表达、肿瘤大小、转移、复发和血清AFP值是影响肝癌患者生存时间的重要因素（P值分别为:0.009、0.002、0.030、0.035、0.002）。多因素分析,发现Tiam1蛋白高表达、肿瘤大小和血清AFP值分别是影响肝癌生存预后的独立因素（P值分别为:0.042、0.008、0.001）。5、Tiam1基因表达沉默对肝癌细胞生物学特性的影响利用软件设计合成Tiam1基因的特异性干扰片段,瞬时转染QGy-7701细胞后,荧光显微镜测定转染效率为60%～70%。荧光定量PCR和Western blot结果显示Tiam1基因干扰效率达72%（命名为QGy-7701/Tiam1-细胞）。MTT法观察Tiam1基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与QGy-7701细胞相比,QGy-7701/Tiam1-细胞的增殖速度明显减慢,并且呈时间依赖关系（F=237.790,P＜0.001）。利用流式细胞术检测两组细胞的细胞周期结果显示QGy-7701/Tiam1-细胞周期中S期的比例明显减少（t=14.177,P＜0.001）,表明Tiam1基因表达沉默后细胞增殖缓慢。结果提示Tiam1基因表达水平减低后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。体外侵袭小室实验检测Tiam1基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变,结果显示,与QGy-7701细胞相比,QGy-7701/Tiam1-细胞的侵袭能力明显降低（t=18.054,P＜0.001）,说明Tiam1基因的沉默抑制了肝癌细胞的侵袭能力。结论1.Tiam1蛋白在多种肿瘤组织中高表达,表明Tiam1可能是导致肿瘤发生发展的重要分子;2.Tiam1蛋白在肝癌组织中高表达,在肝硬化组织中弱表达,而在正常肝组织中不表达,提示Tiam1可作为临床肝癌检测的有重要参考价值的标志物;3.Tiam1蛋白高表达结合临床随访资料分析,表明Tiam1与患者预后密切相关,提示Tiam1可作为肝癌预后判断的重要指标,对判断肝癌预后有重要意义;4.Tiam1基因沉默后可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭,表明Tiam1基因可促进肝癌细胞的增殖和侵袭,提示Tiam1基因在肝癌细胞的增殖和侵袭中起重要作用。本研究的创新之处1.发现Tiam1与肝癌的增殖、侵袭及预后相关,为开展肝癌基因靶向治疗奠定了理论基础;2.建立了Tiam1基因沉默的肝癌细胞株,为研究Tiam1基因在肝癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具。