人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养

论文摘要

人胚胎干细胞（hESCs）有分化为机体各种细胞的潜能,是再生医学、药物筛选及发育研究的一个重要来源。hESCs是从人胚胎细胞分离培养而来的,然而,人胚胎来源不足严重限制了hESCs的研究。以动物卵母细胞为受体、人体细胞为供体细胞的异质核移植技术为hESCs的研究提供了新的途径,本文尝试了用山羊卵母细胞为受体、人包皮成纤维细胞（HFFs）为供体构建人-山羊异质核移植（human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT）胚胎,并分离hESCs,旨在优化hgiNT方案,并为建立hESCs系提供技术帮助。研究内容如下:1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植,本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养,对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养,Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果:共培养组克隆存活率（31.43 %）显著高于对照组（5.56 %）（P<0.05）,与条件培养液组相近（27.27 %,P>0.05）;饲养层共培养组扩大培养率（11.43 %）显著高于对照组（0 %）（P<0.05）。7个细胞克隆中5个表现为正常核型（2n=44+XY）。结果表明,两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持细胞染色体核型正常,用于核移植前供体细胞的筛选。2.为了探索hgiNT条件,本实验首先对电融合参数进行了摸索,进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响,最后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果最佳的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36 V、20μs和2次,最佳的融合与激活间隔时间为4 h,G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显著高于mSOFaa培养法（71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05）。结果表明:hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方（山羊）体细胞核移植相似,而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方（人）的胚胎培养条件。3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100 nM TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果在50、75 nM组,囊胚率有所增高（9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05）;用5,25,50,75或100 nM TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nM组的囊胚率均有所提高,其中25 nM组显著高于对照组（16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05）。TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高克隆胚囊率,说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程,推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的发育率。4.本实验（1）用10 mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷冻-复苏后培养12 h,统计复苏率,选择合适的处理时间;（2）用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层,接种ICM,比较它们对hESCs的支持情况;（3）在不同密度的HFFs饲养层上,接种相同的ICM数,统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率,从中选择合适的饲养层密度。结果显示:（1）以10 mg/L丝裂霉素-C最佳处理时间为2 h;（2）HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态;（3）HFFs饲养层的最佳密度是3×104/mL。五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制,本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs（iNT-hESCs）进行体外培养（HESCO组）,以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组（HFF组）,观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况,探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果,HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性;结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态,这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 动物细胞核移植的研究进展
• 1.1 同种动物核移植的研究现状
• 1.1.1 胚胎细胞来源的同种动物核移植
• 1.1.2 体细胞来源的同种动物核移植
• 1.2 异种动物核移植的研究现状
• 1.2.1 胚胎细胞来源的异种动物核移植
• 1.2.2 体细胞来源的异种动物核移植
• 1.3 动物体细胞核移植的机理
• 2+启动供体核的再程序化'>1.3.1 Ca²⁺启动供体核的再程序化
• 1.3.2 MPF 对供体核的再程序化
• 1.3.3 卵子细胞质对供体核的再程序化
• 1.3.4 DNA 甲基化对供体核的再程序化
• 1.4 动物核移植的应用前景
• 1.4.1 治疗性克隆
• 1.4.2 畜牧业生产
• 1.4.3 核移植技术和转基因技术结合
• 1.4.4 保护濒危野生动物
• 1.4.5 理论价值
• 1.5 动物核移植存在的问题
• 第二章 胚胎干细胞的研究进展
• 2.1 胚胎干细胞的概念和基本特征
• 2.2 ESC 的胚胎来源
• 2.2.1 孤雌激活胚胎
• 2.2.2 胚胎生殖干细胞
• 2.2.3 体外受精胚胎
• 2.2.4 核移植胚胎
• 2.2.5 其他来源
• 2.3 胚胎干细胞研究历史
• 2.4 胚胎干细胞的生物学特征
• 2.4.1 形态学特征
• 2.4.2 核型分析
• 2.4.3 端粒酶活性
• 2.4.4 阶段性特异性胚胎细胞表面抗原的表达
• 2.4.5 转录因子Oct-4 的表达
• 2.4.6 碱性磷酸酶的活性
• 2.4.7 体内外分化能力
• 2.5 胚胎干细胞应用前景
• 2.5.1 克隆和生产转基因动物
• 2.5.2 动物发育生物学研究
• 2.5.3 组织器官修复和移植治疗研究
• 2.6 存在的问题展望
• 第三章 人胚胎干细胞建系方法的研究
• 3.1 HESCS 分离培养的方法
• 3.1.1 ICM 分离的方法
• 3.2 HESCS 培养体系
• 3.2.1 含饲养层的培养体系
• 3.2.2 无饲养层培养体系
• 3.3 胚胎干细胞的传代方法
• 3.3.1 机械法
• 3.3.2 酶消化法
• 3.4 HESCS 的鉴定方法
• 3.4.1 形态学鉴定
• 3.4.2 碱性磷酸酶活性
• 3.4.3 阶段特异性胚胎细胞表面抗原
• 3.4.4 端粒酶活性分析
• 3.4.5 全能性基因的表达
• 3.4.6 核型分析
• 3.4.7 分化潜能
• 3.5 问题与展望
• 第二部分 实验研究
• 前言
• 第四章 人成纤维细胞单克隆的制备及扩大培养
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 主要液体的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 人皮肤组织的采集及原代培养
• 4.2.2 人皮肤成纤维细胞的传代培养及冷冻与复苏
• 4.2.3 细胞单克隆的制备与扩大培养
• 4.2.4 染色体Giemsa 染色的核型分析
• 4.2.5 试验数据的统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 细胞单克隆的分离与扩大培养
• 4.3.2 分离克隆的染色体核型分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 人-山羊异质核移植程序的优化
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验试剂
• 5.1.2 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 供体细胞的准备
• 5.2.2 卵母细胞的体外成熟及核移植
• 5.2.3 电融合
• 5.3 结果
• 5.3.1 电压对人-山羊异质核移植电融合效率的影响
• 5.3.2 脉冲时程对人-山羊异质核移植电融合效率的影响
• 5.3.3 脉冲次数对人-山羊异质核移植电融合效率的影响
• 5.3.4 融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响
• 5.3.5 培养体系对重组胚胎体外发育的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 TSA 处理对人-山羊异质克隆胚胎发育的影响
• 6.1 材料
• 6.1.1 实验试剂
• 6.1.2 实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 TSA 处理供体细胞
• 6.2.2 卵母细胞的体外成熟及核移植
• 6.2.3 电融合
• 6.2.4 克隆胚胎的激活与培养
• 6.2.5 TSA 处理重构胚
• 6.2.6 试验数据的统计分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 TSA对供体细胞的影响
• 6.3.2 TSA 处理供体细胞对克隆胚早期发育力的影响
• 6.3.3 TSA 处理重构胚对克隆胚早期发育的影响
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 不同饲养层对人胚胎干细胞支持情况
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验试剂
• 7.1.2 实验仪器
• 7.1.3 饲养层细胞的准备
• 7.1.4 细胞饲养层的制备
• 7.1.5 人-山羊异质核移植囊胚的生产
• 7.1.6 ICM 的分离
• 7.1.7 摸索适合hESCs 生长的饲养层条件
• 7.1.8 统计学分析
• 7.2 结果
• 7.2.1 丝裂霉素处理时间对不同细胞复苏率的影响
• 7.2.2 不同类型细胞饲养层对hESCs 生长的影响
• 7.2.3 不同密度的饲养层对hESCs 生长的影响
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 INT-HESCS 的无动物源性成份限定性培养
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 实验试剂
• 8.1.2 实验仪器
• 8.1.3 HFF 饲养层细胞的制备
• 8.1.4 iNT-hESCs 细胞的培养、传代
• 8.1.5 iNT-hESCs 的鉴定
• 8.1.6 统计学分析
• 8.2 结果
• 8.2.1 HESCO 对人-山羊异质核移植来源的iNT-hESCs 生长支持情况
• 8.2.2 纤连蛋白对iNT-hESCs 生长的影响
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介