类胰蛋白酶对乳腺癌细胞侵袭力影响及其机制的研究

论文摘要

乳腺癌严重威胁女性健康,发病率呈现逐年上升的趋势。乳腺癌的危害主要体现在其转移,转移是指乳腺癌细胞由其原发部位侵入血管、淋巴管或者体腔后,被血流、淋巴流带到另一部位或器官,形成与原发瘤同样类型的肿瘤的过程,转移是乳腺癌患者死亡的最主要原因,也是该肿瘤恶性程度的重要标志和最本质的表现。本室前期研究发现乳腺肿瘤的病理分型与肿瘤周围组织中肥大细胞数量密切相关。良性肿瘤组织中肥大细胞较少,恶性程度高的浸润性小叶癌和浸润性导管癌组织中肥大细胞明显高于良性肿瘤（p＜0.01）,而恶性程度较低、浸润性不显著的黏液腺癌和髓样癌则介于高恶性和良性肿瘤之间。近年来,肥大细胞与乳腺癌转移和侵袭之间的关系正逐步受到重视。类胰蛋白酶是肥大细胞脱颗粒的主要成分,是一种具有胰蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶,目前其对乳腺癌侵袭力的影响未见报道。本论文首先从健康人肺组织提取类胰蛋白酶,然后使用组织芯片技术研究类胰蛋白酶与乳腺癌病理分级、淋巴结转移之间的关系,继而在体外以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,观察了类胰蛋白酶对其侵袭力的影响及其机制。我们的研究主要分为以下两个部分:第一部分:高活性人类胰蛋白酶的制备。市售类胰蛋白酶价格昂贵,且酶活性不符合实验要求,所以我们使用抗体亲和层析法从人肺组织中提取类胰蛋白酶。主要步骤为:在低温环境中将人肺组织匀浆,与连接有类胰蛋白酶抗体B12的Agarose充分混匀、装柱并收集其洗脱产物,通过SDS-PAGE和发色底物法鉴定其蛋白质分子量和活性。结果显示:自提类胰蛋白酶在SDS-PAGE显示特异性的34kD条带,比活性为60 IU/mg,Km、Vmax分别为0.45mmol/L和161.29μmol/min,以上指标均优于市售类胰蛋白酶。第二部分:类胰蛋白酶对乳腺癌侵袭的影响及其机制研究。①利用组织芯片法观察类胰蛋白酶在乳腺癌周围组织中的分布,并研究其与肿瘤良恶性、分级、淋巴结转移等指标之间的相关性,结果显示:相比正常乳腺,乳腺癌周围组织内类胰蛋白酶阳性颗粒明显增多,有淋巴结转移的Ⅲ级组织中类胰蛋白酶颗粒多于Ⅰ、Ⅱ级组织;Ⅱ级组织有淋巴结转移样本类胰蛋白酶阳性颗粒数是无转移样本的3.6倍;有淋巴结转移组相比无淋巴结转移组,类胰蛋白酶染色颗粒亦增加约1倍,提示了类胰蛋白酶与乳腺癌恶性程度和转移之间呈正相关。②为了模拟肿瘤组织局部环境,我们研究了在不同pH值环境下,类胰蛋白酶对乳腺癌细胞侵袭力的影响。结果得到:pH值7.0时,乳腺癌细胞系MDA-MB-231的体外侵袭能力最强,并将此pH值作为后续研究的实验条件。③利用Transwell小室侵袭体外模型,观察类胰蛋白酶对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭力的影响,结果表明:50 pmol/L、500 pmol/L、1000 pmol/L的类胰蛋白酶都能够明显促进乳腺癌细胞侵袭能力,且在500 pmol/L时这种促进作用最为明显,并呈时间依赖性。④观察了类胰蛋白酶对MDA-MB-231细胞增殖的影响,结果证实:在pH值（7.0）环境下,500 pmol/L的类胰蛋白酶不会引起该细胞系增殖能力的变化。⑤从细胞运动力和细胞外基质降解酶这两个角度,分别利用Transwell小室运动体外模型和明胶酶谱法研究了类胰蛋白酶促进乳腺癌细胞侵袭的机制,结果发现:类胰蛋白酶促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的运动力,激活乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的MMP-2,降解细胞外基质。综上所述,我们成功地从健康人肺组织中提取了类胰蛋白酶;发现当乳腺癌细胞扩增到某一阶段时,大量蓄积的酸性代谢产物刺激肥大细胞脱颗粒,并且上调类胰蛋白酶的活性,进而促进乳腺癌细胞的运动力,激活MMP-2,降解细胞外基质,导致乳腺癌细胞的侵袭力的增强,与组织芯片Ⅲ级组织肿瘤周围组织内类胰蛋白酶含量高于Ⅰ、Ⅱ级一致。本课题研究了类胰蛋白酶对乳腺癌转移的作用及机制,为今后的乳腺癌临床治疗提供了一个可能的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 使用单克隆抗体亲和层析法从人肺组织提取类胰蛋白酶
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 类胰蛋白酶对乳腺癌细胞侵袭力的影响及其机制
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 附录
• 致谢
• 综述 肥大细胞与肿瘤