IDO基因表达在大鼠肝脏移植后急性排斥反应中的作用

论文摘要

研究背景和目的最近发现一类新的DC细胞（dendritic cells，树突状细胞）亚群，能够高表达IDO酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，吲哚胺2，3双加氧酶），加快组织局部色氨酸代谢，从而抑制T细胞增殖、诱导活化的T细胞凋亡，导致外周免疫耐受。这类DC细胞亚群在体外可以被IFNγ干扰素诱导IDO基因的表达。因此，上调DC细胞IDO基因可能成为一种诱导移植后免疫耐受的新策略。本实验主要研究大鼠肝脏移植后IDO基因表达与移植后免疫的关系。在建立稳定的大鼠原位肝脏移植模型基础上，进一步探讨三方面内容：（1）大鼠肝脏移植后移植物中IDO基因表达和IDO酶活性的时相变化；（2）移植物中IDO基因表达和IDO+细胞比率与移植后急性排斥反应严重程度的关系；（3）体外IFNγ诱导DC细胞IDO基因表达在大鼠肝脏移植后急性排斥反应中的治疗作用。本实验采用如下方法：利用RT-PCR、Western-blot以及定量Real-time PCR等分子生物学方法研究IDO基因和蛋白的表达情况；利用抗IDO mAb免疫组化染色显示移植肝内IDO+细胞的细胞类型和部位；采用新建立的大鼠肝脏“微透析-HPLC”技术分析移植肝中IDO酶的在体活性；提取并纯化供体大鼠脾脏DC细胞，体外IFNγ诱导DC细胞表达IDO基因后经门静脉回输移植肝脏，以评价IDO+ DC细胞对肝脏急性排斥反应的治疗作用。本研究将有助于提高对肝脏移植后免疫调节的认识，并可能为肝脏急性排斥反应提供新的治疗手段。第一部分快速法切取供肝及改良袖套技术建立大鼠原位肝脏移植模型目的以二袖套法为基础，探讨影响大鼠原位肝脏移植手术成功的因素，并进行改良。方法采用“快速法”切取供肝、改良的套管技术以及预防腹腔出血等三方面改进措施，对220例大鼠施行原位肝脏移植手术。结果供体手术时间平均21.6±1.95 min，供肝修整时间平均23.1±1.61 min，受体手术时间平均48.1±2.63 min，无肝期为15.9±2.26 min，手术成功率为94.1％（207／220）。同品系移植（SD→SD）大鼠能长期生存，3个月生存率为80.7％，异品系移植（Wistar→SD）大鼠术后第7天发生程度不等的急性排斥反应，随后因排斥导致肝功能衰竭死亡，平均生存时间14.5天。结论利用这种改良方法能够建立稳定的大鼠原位肝脏移植模型，简化了手术过程，提高了手术成功率和动物长期生存率。未经抗排斥治疗的异品系大鼠移植肝脏均发生了程度不等的急性排斥反应，因此可以作为肝脏移植后急性排斥研究的良好模型。第二部分大鼠肝脏移植后移植物中IDO基因表达和IDO酶活性的时相变化目的了解IDO基因表达及IDO酶活性在大鼠肝脏移植后的时相变化，研究IDO与移植后免疫的关系，为进一步研究IDO在移植后免疫调节中的作用机制提供思路。方法1)假手术对照组（n=15）：SD大鼠开腹阻断肝脏血供15分钟，模拟无肝期。2)同品系移植组（n=15）：施行SD→SD大鼠原位肝脏移植术。3)异品系移植组（n=15）：施行Wistar→SD大鼠原位肝脏移植术。各组3只动物于术后第1天植入微透探针，利用“微透析-HPLC”（Microdialysis-HPLC）技术进行肝脏IDO酶活性的在体监测。另外采用RT-PCR技术检测肝脏移植后第2、5、7、14天肝脏IDO mRNA水平。结果假手术对照组术后无急性排斥反应，相应的IDO酶活性和IDO基因表达水平极低。同品系移植组排斥反应相对较轻，相应的IDO基因表达略升高，且持续时间较短，移植肝内IDO酶活性稍增加。异品系移植组排斥反应严重，相应的IDO表达明显升高，且持续时间长，移植肝内IDO酶活性也显著增加，因此色氨酸代谢加快，浓度降低，代谢产物犬尿氨酸浓度升高，并且在较长时间（2周）保持较高水平。结论大鼠原位肝脏移植后移植物IDO酶活性增加，IDO基因表达上调，提示IDO可能参与肝脏移植后免疫调节。本研究中建立的大鼠“肝脏微透析—HPLC”分析技术能够长期动态监测移植后肝脏IDO酶的在体活性，是评价IDO与肝脏移植后免疫关系的良好研究工具。第三部分大鼠肝脏移植后IDO基因表达与急性排斥反应关系的研究目的在第二部分研究中发现了大鼠肝脏移植后IDO基因异常表达以及IDO酶活性显著升高，提示IDO可能参与肝脏移植后免疫调节。但是尚不明确这种IDO基因上调的细胞类型及其与急性排斥反应程度的关系。本研究利用IDO mAb免疫组化染色寻找肝脏移植后肝内IDO+细胞，并通过计算IDO+细胞比率和Real-time PCR方法定量研究IDO与移植后急性排斥严重程度的关系。方法1)异品系肝脏移植组（n=30）：Wistar大鼠供体肝脏移植到SD受体大鼠。2)假手术组（n=10）：阻断肝脏血供15分钟，模拟肝脏移植组无肝期。术后第7天处死动物，取肝脏标本常规病理切片，根据Banff急性排斥标准进行排斥严重程度的分级。再行IDO免疫组化染色、RT-PCR、Western-blot和Real-tiem PCR检测。结果首次发现了一类肝脏移植后IDO+细胞。它们主要分布于肝脏汇管区，形态类似于单核细胞，胞浆呈棕色染色。IDO+细胞比率随急性排斥反应程度加重而成倍增高，IDO基因表达和IDO蛋白水平也相应增加。定量PCR结果提示肝脏IDO mRNA拷贝数也随排斥反应加重而成倍增加。结论IDO基因表达随急性排斥反应加重而上调，提示肝脏移植后IDO基因的异常表达是由于急性排斥反应的发生引起的。而IDO+细胞主要在汇管区浸润，形态类似于单核细胞，其比率随排斥反应加重而增高，提示IDO+细胞可能作为一种特殊类型的致耐受DC细胞亚群参与移植后的免疫调节。第四部分体外IFNγ诱导DC细胞IDO基因表达在大鼠肝脏移植后急性排斥反应中的治疗作用目的通过上调DC细胞IDO基因表达，研究其抗肝脏移植排斥和诱导免疫耐受的能力。方法IFNγ-DC组（n=21）：提取供体大鼠脾脏DC细胞体外培养，IFNγ上调DC细胞IDO基因的表达，于移植后第1天将这种IDO+IFNγ-DC细胞经门静脉注射回输受体大鼠。DC组（n=21）：于移植后第1天将未经IFNγ处理的DC细胞经门静脉回输受体大鼠。结果IFNγ-DC组大鼠较DC组急性排斥症状明显减轻，肝功能恢复良好，生存时间显著延长，病理显示汇管区炎性细胞浸润减少，排斥反应轻。IFNγ-DC门静脉回输受体大鼠后，在移植后早期移植肝内IDO基因水平和IDO酶活性显著上调，此后随急性排斥反应的控制而逐渐降低。而DC组急性排斥症状重，肝功能进行性恶化，动物生存时间缩短，病理显示Ⅱ～Ⅲ级排斥反应。DC门静脉回输受体大鼠后，在移植后早期肝内IDO基因水平和IDO酶活性均较低，此后随急性排斥反应加重而逐渐升高，并持续高表达较长时间（2周以上）。TUNEL法检测IFNγ-DC组肝脏汇管区T细胞凋亡增加，FACS检测外周血中CD4+T细胞凋亡也增加，RT-PCR结果发现Th1细胞分泌的IFNγ细胞因子相对减少，Th2分泌的IL-4、IL-10等细胞因子相对增多。结论IFNγ诱导后IDO+DC细胞具有一定的抗急性排斥反应的作用，可能通过表达IDO酶催化局部色氨酸代谢，促进T细胞凋亡以及诱导Th1／Th2细胞因子免疫偏离等机制导致肝脏移植后免疫耐受。这为治疗肝脏急性排斥反应提供了新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 快速法切取供肝及改良袖套技术建立大鼠原位肝脏移植模型
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 大鼠肝脏移植后移植物中IDO基因表达和IDO酶活性的时相变化
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 大鼠肝脏移植后IDO基因表达与急性排斥反应关系的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 体外IFNγ诱导DC细胞IDO基因表达在大鼠肝脏移植后急性排斥反应中的治疗作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 创新点
• 英文缩写
• 附录
• 附录一 综述
• 附录二 常用试剂的配制
• 附录三 在读期间发表的文章
• 致谢