日本血吸虫期特异性新基因Sj314C10的克隆、表达和功能分析

论文摘要

利用RACE技术钓取日本血吸虫成虫期特异表达基因ESTs的全长cDNA,以期寻找到新的编码日本血吸虫病的诊断抗原或候选分子疫苗。通过分析一系列日本血吸虫成虫期特异表达基因的ESTs,筛选其中一条EST设计巢式PCR引物,进行第一次RACE。纯化目的条带,连接克隆载体,转化宿主菌,筛选阳性克隆测序;将测序结果连接到源序列的EST上;之后进行“电子克隆”得到一新的EST。再以该EST片段设计巢式PCR引物,用相同方法进行第二次RACE,直到序列不再延伸为止。对两次RACE后连接得到的DNA序列进行生物信息学分析,进行GenBank的注册。然后,选取其完整开放阅读框（ORF）设计合成双酶切位点的引物,进行PCR体外扩增,纯化目标条带。连接到相同酶切的原核表达载体pET28a（+）上,转化宿主菌E. coli BL21。用IPTG诱导表达,观察各种条件下对重组菌蛋白表达的影响。回收蛋白,完成表达产物的纯化和生物活性研究,并进行蛋白的功能分析。结果表明经两次RACE扩增,获得了一含完整ORF的全长基因片段,测序及序列分析表明该基因为日本血吸虫一新基因,GenBank注册号为AY847290,命名为Sj314C10（Schistosoma japonicum 314C10 cloning,Sj314C10）。对此基因编码蛋白的结构和功能域分析表明该蛋白氨基酸序列与杆状病毒凋亡抑制蛋白重复结构域有78%的同源性。IPTG诱导该基因的原核表达重组菌,SDS-PAGE发现大约在50ku位置出现一条表达条带,而且随着时间的推移表达产物的量逐渐增大。同时,研究显示:温度、IPTG浓度和表达时相的改变对蛋白包涵体可溶性的表达无显著的影响。动物实验为:Western 印迹显示粗抗原免疫兔血清可以特异地识别此蛋白表达条带,ELISA 表明该蛋白免疫小鼠产生了很高滴度的抗体,用尾蚴感染重组抗原免疫昆明系小鼠,实验组与对照组相比,获得了部分保护作用。

论文目录

• 文献综述
• 第一章 日本血吸虫期特异表达功能基因研究进展
• 1.1 血吸虫基本生物学特征
• 1.1.1 血吸虫生活史及致病机理
• 1.1.2 血吸虫的危害与防制措施
• 1.1.3 血吸虫基因组研究概况
• 1.2 期别差异表达功能基因研究进展
• 1.2.1 血吸虫基因期别差异表达的生物学现象及研究意义
• 1.2.2 血吸虫期别差异表达功能基因的研究进展
• 1.2.3 血吸虫期别差异性表达功能基冈的克隆方法
• 1.3 血吸虫全长基因序列获取的方法
• 1.3.1 已知序列基冈的扩增
• 1.3.2 已知部分序列扩增cDNA 全长基冈的方法
• 1.4 血吸虫疫苗的研究进展
• 1.4.1 血吸虫疫苗候选抗原
• 1.4.2 展望
• 试验研究
• 第二章 日本血吸虫成虫期新基因全长cDNA 的克隆和鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物、尾蚴、钉螺
• 2.1.2 实验的菌株、载体
• 2.1.3 实验工具酶、生化试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要溶液和培养基的配制
• 2.1.6 源序列
• 2.1.7 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 日本血吸虫（中国人陆株）成虫的收集
• 2.2.2 日本血吸虫成虫总 RNA 提取
• 2.2.3 5′RACE 反应原理
• 2.2.4 单链cDNA的环化
• 2.2.5 第一次 RACE 向进行 PCR 扩增
• 2.2 6 第二次 RACE 扩增 DNA 序列
• 2.2.7 Sj314C10 原核表达载体的构建与转化
• 2.3 结果
• 2.3.1 日本血吸虫总 RNA 完整性分析
• 2.3.2 第一次RACE扩增的序列
• 2.3.3 第二次RACE扩增的序列
• 2.3.4 Sj314C10+-ORF 扩增结果
• 2.3.5 重组菌鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 SJ314C10 基冈的生物信息学分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 Sj314C10 全长基因核苷酸序列同源性分析
• 3.2.2 SJ314C10 基因 ORF 及其编码蛋白质性质分析
• 3.2.3 Sj314C10 基因编码蛋白质同源性分析
• 3.2.4 Sj314ClO 基因冈编码蛋白质结构利功能位点分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 对Sj314C10 基冈核苷酸的同源性分析
• 3.3.2 Sj314C10 基因编码蛋白序列的氨基酸组成和核酸对应情况
• 3.3.3 Sj314C10 基因编码蛋白的性质
• 3.3.4 Sj314C10 基因编码蛋白疏水性分析
• 3.3.5 TMHMM 对日本血吸虫 Sj314C10 基因编码蛋白跨膜区分析
• 3.3.6 Sj314C10 基因编码蛋白氨基酸序列同源性分析
• 3.3.7 Sj314C10 编码蛋白质结构功能域分析
• 3.3.8 结构和功能位点分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 SJ314C10 基冈蛋白表达、纯化及复性
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 实验化学试剂
• 4.1.3 实验生化仪器
• 4.1.4 主要配制的溶液
• 4.2 方法
• 4.2.1 Sj314C10 蛋白的表达
• 4.2.2 SDS—PAGE
• 4.2.3 SDS—PAGE 电泳胶干胶的制备
• 4.2.4 Sj314C10 基因编码蛋白表达条件的观察
• 4.2.5 目标蛋白纯化
• 4.2.6 His Bind Resin 的再生和纯化目的蛋白
• 4.2.7 纯化蛋白的复性
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组菌和空载菌经 IPTG 诱导表达,SDS—PAGE 电泳分析
• 4.3.2 温度对融合蛋白表达
• 4.3.3 诱导浓度对重组蛋白表达的影响
• 4.3.4 诱导表达时间对重组蛋白表达的影响
• 4.3.5 重组蛋白的纯化
• 4.3.6 纯化蛋白浓度
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 重组蛋白功能的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 血吸虫
• 5.1.3 其他生化原料
• 5.1.4 主要的溶液
• 5.2 方法
• 5.2.1 制备日本血吸虫粗抗原
• 5.2.2 日本血吸虫纯化抗原的制备
• 5.2.3 兔抗日本血吸虫（中国人陆株）成虫血消的制备
• 5.2.4 Western Blotting 目标蛋白抗原性检测
• 5.2.5 重组蛋白免疫小白鼠抗体变化分析
• 5.2.6 小白鼠尾蚴感染后的减虫率减卵率统计
• 5.3 结果
• 5.3.1 粗抗原免疫兔血清监测
• 5.3.2 表达产物 Western blotting 分析
• 5.3.3 ELISA 分析重组蛋白免疫鼠抗体变化分析
• 5.3.4 重组抗原动物保护实验
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录（缩略语）
• 致谢
• 个人简历