论文摘要
随着免疫缺陷人群尤其是艾滋病患者的增多,侵袭性真菌感染的发病率不断增高。尽管白念珠菌仍是临床最为常见的真菌,但近年来白念珠菌的分离率有所下降,而对氟康唑敏感性低的非白念珠菌的分离率有所升高,其中,由光滑念珠菌所引起的黏膜和系统性感染明显增加,在某些地区光滑念珠菌已成为仅次于白念珠菌的第二位或第三位的常见念珠菌。光滑念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性低,而近年来光滑念珠菌对氟康唑的耐药率呈上升趋势,耐药性已成为影响临床治疗光滑念珠菌感染疗效的主要原因。因此,研究光滑念珠菌耐药性的形成机制是一项极其紧迫的课题。1.艾滋病合并侵袭性真菌感染病例回顾性研究本研究对上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心白2004年12月至2006年5月收治的艾滋病合并侵袭性真菌感染病例进行回顾性研究,分析艾滋病患者侵袭性真菌感染的流行状况、临床特点、病原菌分布与耐药情况、治疗以及预后,以明确艾滋病患者侵袭性真菌感染的流行特点,提高防治水平。结果显示:85例艾滋病患者中,合并侵袭性真菌感染35例,发生率为41.2%;消化道真菌感染占44.4%;白念珠菌占致病菌的57.4%,非白念珠菌占22.3%;39.5%的白念珠菌对氟康唑耐药,非白念珠菌对氟康唑的耐药率为41.7%;71.8%的病例发生于CD4+T淋巴细胞计数＜100/μl的患者;35例侵袭性真菌感染患者均接受了抗病毒以及抗真菌治疗,其中27例治愈,8例死亡。研究显示侵袭性真菌感染是艾滋病患者主要的机会感染之一,其发生与CD4+T淋巴细胞计数密切相关;临床上以消化道真菌感染为多见;致病菌主要为白念珠菌,非白念珠菌呈增多趋势,分离自艾滋病患者的念珠菌对常用三唑类抗真菌药物的耐药率高;艾滋病患者侵袭性真菌感染的预后差,病死率高。2.非白念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性分析为了解非白念珠菌对我国常用抗真菌药物的耐药状况,本研究使用RoscoNeo-Sensitab纸片扩散法检测116株非念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性。结果显示:除2株光滑念珠菌对两性霉素B耐药外,其他菌株均对两性霉素B敏感;86.4%的热带念珠菌和80%的近平滑念珠菌对氟康唑敏感;光滑念珠菌对两性霉素B、氟康唑和伊曲康唑的耐药率分别为3.6%、16.1%和10.7%;所有克柔念珠菌对氟康唑和氟胞嘧啶均耐药。本研究提示绝大多数非白念珠菌对两性霉素B敏感,克柔念珠菌对氟胞嘧啶及三唑类抗真菌药物的耐药率高,光滑念珠菌对常用抗真菌药物包括两性霉素B的敏感性低,对三唑类抗真菌药物的耐药率高,且对三唑类抗真菌药物存在交叉耐药。3.耐氟康唑光滑念珠菌ERG11基因突变分析ERG11基因突变是否与光滑念珠菌耐药性有关目前尚无定论,为进一步探讨ERG11基因突变在光滑念珠菌耐药形成中的作用,本研究将ERG11基因克隆到pUC57-T载体,利用载体上的“通用引物”对ERG11基因整个开放读码框进行双向测序,将测序结果与网上公布的标准序列进行比对。结果发现光滑念珠菌耐药株和敏感株ERG11基因共存在10个点突变,均为同义突变,无错义突变和移码突变。其中5个点突变在耐药株和敏感株中均出现,3个只出现在耐药株中,2个只出现在敏感株中。点突变主要位于ERG11基因1320-2200 bp的部位。以上结果证实光滑念珠菌ERG11基因序列存在多态性,本研究未发现因ERG11基因突变引起靶酶氨基酸改变而导致的光滑念珠菌对氟康唑耐药。4.光滑念珠菌ERG11、CDR1及CDR2基因表达与氟康唑耐药的关系为进一步探讨光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的机制,本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术对光滑念珠菌临床分离株ERG11、CDR1和CDR2基因表达的mRNA进行相对定量,比较氟康唑耐药株与敏感株基因表达水平的差异,从而探讨基因表达与耐药性之问的关系。结果显示:光滑念珠菌氟康唑耐药株ERG11基因mRNA的表达量高于敏感株;耐药株和剂量依赖性敏感株CDRl基因mRNA的表达量均高于敏感株;耐药株CDR2基因mRNA的表达量高于敏感株。随着光滑念珠菌对氟康唑敏感性的降低,ERG11、CDR1及CDR2基因mRNA的表达量均不同程度上升。本研究说明ERGl 1、CDRl及CDR2基因mRNA的上调表达与光滑念珠菌临床分离株对氟康唑的耐药性有关,ERGl 1、CDRl及CDR2基因上调表达是光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的主要分子机制。5.光滑念珠菌氟康唑耐药株与敏感株比较蛋白质组研究已经发现的耐药相关基因以及相关机制只能部分解释临床真菌的耐药性,更多的耐药相关基因有待发现和研究。本研究采用比较蛋白质组研究技术比较光滑念珠菌氟康唑耐药株和敏感株蛋白质组的差异,从蛋白质水平研究光滑念珠菌耐药机制,为发现和研究新的耐药相关基因提供理论基础。本研究共发现12种差异表达蛋白质,其中8种在耐药株中表达上调,4种在敏感株中表达上调。这些差异蛋白质属于能量代谢相关酶类、应激反应蛋白质及大分子合成相关蛋白质等。本研究说明能量代谢相关酶类、应激反应蛋白质及大分子合成相关蛋白质等均有可能参与了光滑念珠菌耐药性的形成,进一步证实了光滑念珠菌耐药性的形成是多种机制共同作用的结果,为发现和研究新的耐药相关基因和耐药机制提供了理论基础。