壬基酚对中国林蛙精巢中StAR的影响

论文摘要

随着现代工业的快速发展,酚类化合物在人类生产和生活中被广泛应用,大量酚类化合物被排放到环境中,对人类及野生动物的生存环境形成不同程度的污染。壬基酚（Nonylphenol,NP）的化学性质稳定、降解较慢,易进入生物体内,对动物的生殖和发育具有雌激素效应,可导致大多脊椎动物生殖能力下降,生殖异常,干扰正常内分泌系统。类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）是类固醇激素合成过程中一个关键因子,将胆固醇从线粒体外膜运送到线粒体内膜,使类固醇激素合成的后续反应得以继续。目前,关于酚类物质干扰动物类固醇激素合成中关键酶的报道较多,但有关NP对两栖动物StAR影响的研究报道仍少见。本实验以中国林蛙（Rana chensinensis）为研究对象,探讨NP对中国林蛙精巢中StAR mRNA及StAR蛋白的影响,旨在揭示酚类环境雌激素水域污染影响两栖动物类固醇激素合成与分泌的机制,为由NP污染导致两栖类繁殖能力下降提供合理的诠释。实验将雄性中国林蛙持续暴露于10-5、10-6、10-7M NP水体中10d、20d、30d以0.1%乙醇作为溶剂对照；取其精巢组织,用原位杂交方法检测StAR mRNA的表达,用免疫组织化学方法检测StAR蛋白的表达。实验结果及结论如下：1.提取总RNA后,测定RNA OD值,OD260/OD280比值在1.8和2.0之间。电泳检测结果显现28S、18S、5S三条带,说明样品纯度合格。成功扩增了273 bp StAR基因cDNA序列,经测序与牛蛙（Rana catesbeiana） StAR mRNA相似性为96%,与粗皮蛙（Rana rugosa）相似性为95%,与热带爪蟾（Xenopus tropicalis）相似性为75%,初步确定所获序列为StAR基因cDNA序列的一个片段。将该片段成功转化后提取质粒测序,结果确定插入片段为目的片段,将质粒线性化后,成功合成RNA探针。2.用合成的探针进行原位杂交反应,检测NP处理组和对照组中国林蛙精巢中StAR mRNA的表达,结果StAR mRNA阳性反应主要存在于间质细胞,支持细胞中较少。这与精巢内间质细胞合成性类固醇激素的功能相一致。3.用免疫组织化学法检测精巢中StAR蛋白,StAR阳性反应主要在间质细胞,支持细胞中仅有少量,此结果与原位杂交StAR mRNA表达的位置一致。StAR表达相对值的单因素方差分析结果显示,在10-5M NP处理组,各处理时间内StAR表达相对值与空白对照相比均略微偏低,变化无显著性差异（P>0.05）。表明10-5M NP处理对StAR的表达存在微弱抑制,推测这一浓度NP对动物产生轻度的毒性,抑制StAR的表达。在10-6M NP处理组,随着处理时间的增加StAR表达相对值逐渐增大。在各处理时间内,StAR表达相对值与对照相比变化极显著（P<0.01）。30d时StAR表达量最大,表明StAR表达量与处理时间存在时间累积效应。在10-7M NP处理组,随处理时间增加StAR表达相对值增大。处理10d时,StAR表达相对值与对照相比变化不显著（P>0.05）,20d与30d时与对照相比变化极显著（P<0.01）,但处理20d与30d后的表达相对值基本相同。推测在这一处理浓度,动物可通过自我调节,减弱或清除NP的干扰效应。表明StAR表达量与NP呈现明显的剂量效应关系。4.相同处理时间比较,处理10d时,10-5M NP处理组中的StAR表达相对值略微低于对照,10-7M NP处理组略微高于对照,变化均不显著（P>0.05）,10-6M NP处理组中的StAR表达相对值明显高于对照,变化极显著（P<0.01）。处理20d时,StAR表达相对值在10-5M NP处理组中明显低于对照,变化显著（P<0.05）,在10-6M、10-7M NP处理组中高于对照,变化极显著（P<0.01）。表明10-6M、10-7M NP上调了StAR的表达。10-6M NP处理组的StAR表达相对值高于10-7M NP处理组。处理30d时,在10-5M NP处理组中,StAR表达相对值与空白对照相比无显著性差异（P>0.05）,在10-6M NP、10-7M NP处理组中均高于对照,变化极显著（P<0.01）。此时,10-6M NP处理组的StAR表达相对值较10-7M NP处理组更高。在10-6MNP浓度组处理30d后,StAR表达相对值达到最大。推测10-6M是NP调节StAR的临界浓度。表明StAR表达量与NP呈现明显的时间累积效应关系。5.本实验中乙醇作为溶剂对照,经含0.1%乙醇的水体暴露后,精巢的StAR表达相对值与空白对照未显示显著性差异（P>0.05）。说明用0.1%乙醇不会影响StAR表达。上述结果表明,在一定浓度范围内,NP能够影响中国林蛙精巢间质细胞与支持细胞中类固醇激素合成中的关键性酶StAR的表达,高浓度NP抑制StAR的表达,低浓度上调StAR的表达。提示NP通过调控StAR的表达来干扰动物的内分泌活动。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 酚类对动物性腺中类固醇激素合成影响的研究进展
• 1 酚类对性类固醇激素水平的影响
• 2 StAR的研究进展
• 2.1 StAR的分子结构及其保守性
• 2.2 StAR蛋白和mRNA表达的调控
• 3 酚类对StAR的影响
• 4 存在问题与展望
• 第二章 壬基酚对中国林蛙精巢中StAR的影响
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3 方法
• 3.1 动物处理
• 3.2 取材
• 3.3 cDNA模板合成
• 3.4 StAR RNA探针合成
• 3.5 原位杂交反应程序
• 3.6 免疫组织化学程序
• 3.7 统计处理
• 4 结果与分析
• 4.1 StAR片段测序及探针合成
• 4.2 NP处理后中国林蛙精巢中StAR的表达
• 5 讨论
• 总结
• 参考文献
• 图版
• 图版说明
• 符号说明
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果