内生细菌EBS05代谢活性物质的分离纯化及抗烟草花叶病毒活性的初步研究

论文摘要

EBS05是一株从樟树周皮组织中分离的内生细菌,对多种植物病原菌真菌和烟草花叶病毒具有较强的拮抗活性,且具有耐酸碱、耐盐、耐高温、抗生作用稳定等作为生防因子的优良特性。为了进一步研究和挖掘EBS05的生防潜力,本文对樟树内生细菌EBS05的分类鉴定、代谢活性物质分离纯化、结构鉴定及其抗病毒活性进行了系统研究,主要研究结果如下:1、在形态学分类的基础上,通过16S rDNA和16S-23S rDNA ISR（Itergenic spacer regions）序列分析,对樟树内生细菌EBS05进行了分类鉴定。结果表明,EBS05为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。2、EBS05代谢活性物质特性研究结果表明,活性物质在λ213.5nm处有最大光吸收峰;在pH5-8范围内抗菌活性稳定,当pH＜5或pH＞10时,抗菌活性显著降低;热稳定性良好,60℃-80℃处理2h后,抗菌活性不变,0.1Mpa、121℃湿热灭菌处理30min后,抗菌活性仍然保持在65%以上;具有较强的抗紫外线照射能力,对蛋白酶K不敏感;具有较好的醇溶性,易溶于甲醇和乙醇,不溶于乙酸乙酯、乙腈和石油醚等有机溶剂。3、在明确代谢活性物质特性的基础上,探索了活性组分分离纯化的条件和工艺。发酵液经酸沉淀（pH2.0）后,用甲醇提取3次,蒸干后的样品上Sephadex LH-20层析柱,用甲醇洗脱,然后以氯仿:甲醇:水（65:25:4）为洗脱液进行硅胶柱层析,再经制备型反相C18HPLC分离,收集活性峰,收集液经冷冻干燥后即得活性组分纯品。4、活性组分纯品经氨基酸组分分析和串联质谱分析表明,EBS05所产生的抗TMV活性组分为4个分子量相差14D的脂肽类同系物,其分子量分别为1035.65D、1021.64D、1007.63D和993.65D。脂肽的肽链结构为[Glu·Leu·Leu·Val·Asp·Leu·Leu],分子结构式为:5、EBS05代谢活性物质抗TMV活性的研究结果表明,代谢活性物质不仅对TMV有较强的体外钝化作用,而且能有效抑制TMV在寄主体内的增殖,对TMV-CP体外聚合和抗原位点也具有一定的抑制和干扰作用,但对TMV粒体形态没有直接破坏作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 一、 文献综述
• 1 枯草芽孢杆菌与植物病害生物防治
• 1.1 对植物真菌病害的防治效果
• 1.2 对植物细菌病害的防治效果
• 1.3 对植物其它病害的防治效果
• 2 枯草芽孢杆菌代谢活性物质的研究进展
• 2.1 脂肽类抗生素
• 2.2 羊毛硫抗生素
• 2.3 多肽类抗生素
• 2.4 活性蛋白类
• 2.5 酶类
• 2.6 其它活性物质
• 3 枯草芽孢杆菌生防机制的研究
• 3.1 竞争作用
• 3.2 拮抗作用和溶菌作用
• 3.3 诱导植物抗病性
• 3.4 促进植物生长
• 4 枯草芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用
• 5 结语
• 二、 引言
• 三、 材料与方法
• 1 内生菌EBS05的分类鉴定
• 1.1 试验材料
• 1.2 形态鉴定
• 1.3 生理生化鉴定
• 1.4 16S rDNA序列分析
• 1.5 16S-23S rDNA ISR序列分析
• 2 EBS05的代谢活性物质的理化性质分析
• 2.1 发酵液的制备
• 2.2 EBS05活性物质粗提物的制备
• 2.3 EBS05生长曲线的测定
• 2.4 EBS05粗提物的抗菌谱试验
• 2.5 紫外吸收特性测定
• 2.6 酸碱稳定性测定
• 2.7 热稳定性测定
• 2.8 对紫外线和蛋白酶K稳定性的测定
• 2.9 溶解性试验
• 2.10 显色反应
• 3 EBS05粗提物的分离纯化
• 3.1 发酵液预处理
• 3.2 Sephadex LH-20柱层析
• 3.3 硅胶柱层析
• 3.4 HPLC检测及制备
• 4 EBS05代谢活性物质的结构分析
• 4.1 氨基酸分析
• 4.2 串联质谱分析
• 5 EBS05代谢活性物质抗TMV活性的初步研究
• 5.1 TMV的提纯
• 5.2 提纯病毒的电镜观察及浓度计算
• 5.3 抑制TMV侵染作用的测定
• 5.4 对TMV体内增殖抑制作用的测定
• 5.5 对TMV粒体形态作用的测定
• 5.6 对TMV外壳蛋白作用的测定
• 四、 结果与分析
• 1 EBS05的分类鉴定结果
• 1.1 形态特征
• 1.2 生理生化鉴定结果
• 1.3 16S rDNA序列分析结果
• 1.4 16S-23S rDNA ISR序列分析结果
• 1.5 小结
• 2 EBS05代谢抗活性物质的理化性质
• 2.1 EBS05生长曲线的测定
• 2.2 活性物质的抗菌谱
• 2.3 活性物质的紫外吸收特性
• 2.4 活性物质的酸碱稳定性
• 2.5 活性物质的热稳定性
• 2.6 活性物质对紫外线、蛋白酶K的稳定性
• 2.7 活性物质的溶解性
• 2.8 活性物质的显色反应
• 2.9 小结
• 3 EBS05代谢活性物质的分离纯化结果
• 3.1 发酵液预处理
• 3.2 Sephadex LH-20柱层析结果
• 3.3 硅胶柱层析结果
• 3.4 HPLC分析及纯品制备
• 3.5 小结
• 4 EBS05代谢活性物质的结构分析
• 4.1 氨基酸分析结果
• 4.2 串联质谱分析结果
• 4.3 小结
• 5 EBS05代谢活性物质抗烟草花叶病毒活性的测定结果
• 5.1 提纯病毒的电镜观察及浓度测定
• 5.2 对TMV体外钝化作用
• 5.3 对TMV体内增殖的抑制作用
• 5.4 对TMV粒体形态的影响
• 5.5 对TMV-CP体外聚合的影响
• 5.6 对TMV-CP抗原位点的作用
• 5.7 小结
• 五、 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 关于植物内生细菌的分类鉴定
• 2.2 关于EBS05代谢活性物的理化性质
• 2.3 关于EBS05代谢活性物的分离纯化工艺
• 2.4 关于EBS05代谢活性物质的化学结构
• 2.5 关于EBS05代谢活性物质的抗TMV活性
• 参考文献
• ABSTRACT