马鹿精子膜蛋白提取方法筛选及电泳体系优化的研究

论文摘要

成熟精子的膜表面含有多种膜蛋白,有些是精子本身固有的,有些是在精子成熟过程中粘附到精子表面的。精子膜蛋白是精子发生、成熟过程中的重要标志。随着生命科学的发展,人们发现精子膜蛋白在维持精子形态结构完整、完成精子的新陈代谢和生殖功能中发挥着重要的作用,特别是与精卵识别、精卵结合以及质膜融合等受精活动密切相关。其中部分可作为抗原诱导机体产生相应的抗体,进而影响精子的受精能力,导致免疫性不育。本文以我国重要的经济动物——马鹿的精子作为实验材料,筛选出了马鹿精子膜蛋白提取的适宜方法、建立了其裂解液的理想体系、确定了其SDS-PAGE电泳的最佳条件,同时对其理化性质进行了初步分析。现将研究结果简述如下:1、马鹿精子膜蛋白提取方法的确定采用三种方法对马鹿精子膜蛋白进行提取,根据SDS-PAGE电泳和BCA蛋白含量检测结果确定了NP-40裂解法为马鹿精子膜蛋白提取的适宜方法。2、马鹿精子膜蛋白裂解液体系的建立对马鹿精子膜蛋白裂解液中去垢剂NP-40和蛋白酶抑制剂PMSF各设立四个浓度梯度,对裂解液添加体积设立三个梯度,根据SDS-PAGE电泳和BCA蛋白含量检测结果确定了NP-40浓度为0.5%、PMSF浓度为0.5mM、提取时添加裂解液体积为5倍是膜蛋白裂解液的理想体系。3、马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳的最佳条件的确定对马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳分离胶设立四个浓度梯度,根据电泳结果确定12%为马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳的最佳凝胶条件。4、马鹿精子膜蛋白的理化性质研究发现:（1）共有8种不同分子量的马鹿精子膜蛋白被提取出来;（2）马鹿精子膜蛋白的总含量为468.12μg/ml;（3）马鹿精子膜蛋白有3条较清晰的糖蛋白带,分别与SDS-PAGE电泳图谱上分子量为98.4 kDa、67.6 kDa和47.3 kDa的膜蛋白带相一致。5、马鹿精子膜蛋白的双向电泳实验对不同细胞裂解方法提取获得的马鹿精子膜蛋白的双向电泳结果进行比较,发现采用尿素—盐酸胍两步法裂解精子能获得较好的双向电泳效果。采用软件对图谱进行分析,可检测出约823个蛋白质点,分子量基本分布在10～100 kDa,等电点约为PI 4～9的区域内。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 精子膜蛋白的研究现状
• 1.1.1 与精子活动有关的膜蛋白
• 1.1.2 与精卵相互作用有关的膜蛋白
• 1.1.3 与生殖免疫有关的蛋白
• 1.1.4 与性别控制有关的蛋白
• 1.2 精子膜蛋白的研究方法
• 1.2.1 精子膜蛋白的提取
• 1.2.2 精子膜蛋白的电泳技术
• 1.3 马鹿精子膜蛋白的研究概况
• 2 马鹿精子膜蛋白的提取
• 2.1 马鹿精子膜蛋白的提取
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 药品及溶液的配制
• 2.1.4 马鹿精子膜蛋白提取方法的筛选
• 2.1.5 马鹿精子膜蛋白提取缓冲液体系的优化
• 2.2 SDS-PAGE电泳
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验器材
• 2.2.3 药品及溶液的配制
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳
• 2.3 蛋白含量检测
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验仪器
• 2.3.3 药品及溶液的配制
• 2.3.4 含量测定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 马鹿精子膜蛋白提取方法的筛选
• 2.4.2 马鹿精子膜蛋白提取缓冲液体系的优化
• 2.4.3 马鹿精子膜蛋白的SDS-PAGE电泳
• 2.5 讨论
• 2.5.1 马鹿精子膜蛋白的提取方法的筛选
• 2.5.2 马鹿精子膜蛋白提取缓冲液体系的优化
• 2.6 本章小结
• 3 马鹿精子膜蛋白的理化性质研究
• 3.1 马鹿精子膜蛋白SDS-PAGE电泳体系的筛选
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 药品及试剂
• 3.1.4 SDS-PAGE电泳体系的筛选
• 3.2 马鹿精子膜蛋白分子量的测定
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验药品及溶液配制
• 3.2.4 分子量的测定
• 3.3 马鹿精子膜蛋白含量的测定
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验仪器
• 3.3.3 实验药品及溶液配制
• 3.3.4 蛋白含量测定
• 3.4 马鹿精子膜糖蛋白的测定
• 3.4.1 实验材料
• 3.4.2 实验仪器
• 3.4.3 实验药品及溶液配制
• 3.4.4 糖蛋白测定
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 精子膜蛋白SDS-PAGE电泳体系的筛选
• 3.5.2 精子膜蛋白的分子量测定结果
• 3.5.3 马鹿精子膜蛋白含量的测定结果
• 3.5.4 马鹿精膜糖蛋白的测定
• 3.6 讨论
• 3.6.1 SDS-PAGE电泳体系的筛选
• 3.6.2 精子膜蛋白含量的测定方法
• 3.6.3 精子膜蛋白的糖蛋白检测
• 3.6.4 精子膜蛋白的理化性质
• 3.7 本章小结
• 4 马鹿精子膜蛋白的双向电泳初步研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验药品及溶液的配制
• 4.1.3 马鹿精子膜蛋白的提取
• 4.1.4 马鹿精子膜蛋白的双向电泳
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 Bradford法检测精子膜蛋白含量的结果
• 4.2.2 NP-40裂解法提取的精子膜蛋白双向电泳结果
• 4.2.3 尿素裂解液一步裂解法提取的精子膜蛋白双向电泳结果
• 4.2.4 尿素—盐酸胍两步裂解法提取的精子膜蛋白双向电泳结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 马鹿精子膜蛋白的双向电泳
• 4.3.2 影响双向电泳图谱效果的因素
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢