受精蛋白与非受精蛋在孵化条件下抗菌活性的初步研究

论文摘要

孵化条件下禽蛋的抗菌问题研究较少,国内外一般只对受精蛋在孵化过程中的理化性质和物质交换进行研究。为了探明受精蛋在孵化条件下的抑菌机制,本文采用浸泡接种法对受精蛋与非受精蛋在孵化条件下抗菌性质的变化进行了比较分析。并且分别对分离的受精蛋与非受精蛋蛋清、蛋壳与壳膜在孵化条件下抗菌性的变化进行了比较。另外对在孵化条件下受精蛋与非受精蛋蛋清中两种主要的抗菌蛋白（溶菌酶、卵转铁蛋白）含量的变化进行了比较研究。本研究对不同孵化阶段,受精蛋与非受精蛋抗肠炎沙门氏菌的能力进行了比较研究。利用1×105 cfu/mL Salmonella Enteritidis （SE）菌悬液接种受精蛋和非受精蛋,测定在不同孵化时间蛋壳与壳膜、蛋清、蛋黄的SE的侵染比例。结果表明：孵化4d,受精蛋蛋壳与壳膜、蛋清比非受精蛋抗肠炎沙门氏菌活性强（P<0.05）,两种蛋的蛋黄样本都未受到侵染；孵化8、12d,两种蛋的三个部位样品肠炎沙门氏菌的阳性比例没有显著性差异（P>0.05）；孵化17d,受精蛋蛋壳与壳膜、蛋黄抗肠炎沙门氏菌活性显著高于非受精蛋（P<0.05）,此时受精蛋鸡胚的漂洗物肠炎沙门氏菌阳性率为13.78%,非受精蛋蛋清肠炎沙门氏菌阳性率为45.16%。通过测定孵化过程中受精蛋与非受精蛋蛋清干重以及含水量的变化,发现蛋清在孵化过程中被浓缩,且受精蛋蛋清的浓缩作用更大。同时测定了蛋清在孵化过程中pH的变化,发现受精蛋蛋清pH由孵化初期的8.94,在孵化2d时升至9.30,然后逐渐降低降至8.40,非受精蛋蛋清pH逐渐变大,由孵化初期的9.22升至9.69。蛋清pH的变化限制了SE在蛋清中的生长。以孵化后的受精蛋与非受精蛋蛋清为介质,对其抗菌活性进行了比较。发现蛋清对本实验所用菌株（肠炎沙门氏菌CMCC（B）50041、金黄色葡萄球菌ATCC6538、CP5型金黄色葡萄球菌、大肠杆菌8099、猪霍乱沙门氏菌C78-1）皆具有抑制作用,且不同孵化天数的受精蛋和非受精蛋蛋清的抑菌活性有差异,同一孵化天数的受精蛋与非受精蛋蛋清的抑菌活性也具有一定的差异。无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌,受精蛋与非受精蛋蛋清的抑菌性在孵化的第2d最强,之后两者的抗菌性均逐渐减弱,蛋清对革兰氏阳性菌具有更好的杀灭作用。对于革兰氏阴性菌来说,受精蛋与非受精蛋蛋清经过孵化0、1、2d,受精蛋蛋清与非受精蛋蛋清的抑菌活性基本等同。孵化3、4d时,受精蛋蛋清的抑菌活性比非受精蛋蛋清弱。对于革兰氏阳性菌来说,受精蛋与非受精蛋蛋清经过孵化0、1、2、3d,受精蛋蛋清与非受精蛋蛋清的抑菌活性基本等同。孵化4d时,受精蛋蛋清的抑菌活性比非受精蛋蛋清的强。孵化4d时,受精蛋的抗肠炎沙门氏菌的活性高于非受精蛋,而此时受精蛋蛋清的抗肠炎沙门氏菌的活性弱于非受精蛋蛋清。这说明：孵化前期蛋清并不是主要的抵抗SE侵入的屏障。因此,通过建立蛋壳穿透模型比较孵化前期SE穿透受精蛋与非受精蛋蛋壳与壳膜的能力。结果发现：受精蛋孵化Od与孵化1-4d的蛋壳与壳膜在抵抗SE穿透能力上具有显著性差异（P<0.05）,SE穿透时间从第Od的81.6h下降到第4d的60.0h。非受精蛋孵化0-4d的蛋壳与壳膜在抵抗SE穿透上不具有显著性差异（P>0.05）,蛋壳的平均抑菌时间变化不大,一直维持在58-63h之间。0-4d,受精蛋蛋壳比非受精蛋蛋壳的抑菌时间长19.2、5.4、5.4、6.5、1.2h。为了进一步揭示受精蛋与非受精蛋蛋清抗菌性差异的原因,本研究还采用分光光度法对蛋清中两种主要抗菌蛋白在孵化条件下含量的变化进行了测定和比较。结果发现：孵化过程中,受精蛋与非受精蛋蛋清中溶菌酶的含量先增大后减少,受精蛋蛋清中溶菌酶含量由孵化0d的3.78mg/mL升至最大值5.23mg/mL（孵化2d）。非受精蛋蛋清中溶菌酶的含量由孵化0d时的3.86mg/mL升至最大值4.71mg/mL（孵化3d）。孵化3、4d时的受精蛋蛋清中溶菌酶的含量高于非受精蛋蛋清,由于溶菌酶主要作用于革兰氏阳性菌,说明3-4d时,受精蛋蛋清的抗革兰氏阳性菌的能力高于非受精蛋,这与第三章的结果相吻合。孵化过程中,受精蛋与非受精蛋蛋清中卵转铁蛋白的含量先增大后减少,孵化0d时受精与非受精蛋中卵转铁蛋白含量分别为4.17mg/mL、4.31mg/mL。在孵化2d时,卵转铁蛋白含量达到最大值,分别为：6.57mg/mL和6.28mg/mL。溶菌酶和卵转铁蛋白含量的变化与蛋清抗菌性的变化存在一定的联系。溶菌酶和卵转铁蛋白含量上升时,蛋清的抗菌性增强。溶菌酶和卵转铁蛋白含量下降时,蛋清的抗菌性减弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 受精蛋与非受精蛋的形态差异
• 2 鸡蛋的非特异性抗菌屏障
• 2.1 蛋壳与壳膜
• 2.2 蛋清
• 2.2.1 溶菌酶
• 2.2.2 卵转铁蛋白
• 2.2.3 蛋清在孵化中的变化
• 3 细菌侵入非受精蛋与受精蛋的途径
• 3.1 垂直传播污染
• 3.2 水平传播理论
• 3.3 受精蛋与非受精蛋抗沙门氏菌侵入的比较
• 4 鸡胚发育的关键时期
• 5 课题构想
• 5.1 本课题研究意义
• 5.2 本课题的研究内容
• 第二章 受精蛋与非受精蛋在孵化条件下抗S.Enteritidis（SE）的差异研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料鸡蛋
• 1.1.2 试剂与药品
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 一定浓度菌悬液的配置
• 1.2.2 最佳接种浓度的确定
• 1.2.3 微生物培养物
• 1.2.4 孵化条件
• 1.2.5 鸡蛋的接种
• 1.2.6 鸡蛋的孵化和取样
• 1.2.7 沙门氏菌的判定
• 1.2.8 孵化过程中受精蛋与非受精蛋蛋清干重以及含水量的测定
• 1.2.9 孵化过程中受精蛋与非受精蛋蛋清pH值的测定
• 1.2.10 不同pH值下蛋清中SE生长的曲线的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 受精蛋与非受精蛋蛋壳与壳膜对SE的抵御
• 2.2 受精蛋与非受精蛋蛋清对SE的抵御
• 2.3 受精蛋与非受精蛋蛋黄对SE的抵御
• 2.4 孵化过程中受精蛋与非受精蛋蛋清干重以及含水量的变化
• 2.5 孵化过程中受精蛋与非受精蛋蛋清pH值的变化
• 2.6 不同pH值对蛋清中SE生长的影响
• 3 讨论
• 第三章 受精蛋与非受精蛋蛋清在孵化条件下抗菌活性的比较分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料鸡蛋
• 1.1.2 试剂与药品
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌OD值与浓度的标准曲线测定
• 1.2.2 细菌在受精蛋与非受精蛋中生长曲线的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 大肠杆菌在受精蛋与非受精蛋蛋清中的生长曲线
• 2.2 肠炎沙门氏菌在受精蛋与非受精蛋蛋清中的生长曲线
• 2.3 金黄色葡萄球菌在受精蛋与非受精蛋蛋清中的生长曲线
• 2.4 CP5型金黄色葡萄球菌在受精蛋与非受精蛋蛋清中的生长曲线
• 2.5 猪霍乱沙门氏菌C78-1在受精蛋与非受精蛋蛋清中的生长曲线
• 3. 结论
• 第四章 孵化前期SE穿透受精与非受精蛋蛋壳比较分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料鸡蛋
• 1.1.2 试剂与药品
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验鸡蛋的处理
• 1.2.2 SE穿透蛋壳模型的建立
• 1.2.3 一定浓度菌悬液的配置
• 1.2.4 鸡蛋的接种
• 1.2.5 沙门氏菌穿透的检测
• 2 结果与分析
• 3 结论
• 第五章 受精与非受精蛋蛋清中两种抗菌蛋白在孵化过程中的含量变化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料鸡蛋
• 1.1.2 试剂与药品
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 溶菌酶标准曲线的测定
• 1.2.2 蛋清溶液的测定
• 1.2.3 卵转铁蛋白标准曲线的测定
• 1.2.4 卵转铁蛋白含量的测定
• 1.2.5 蛋清的准备
• 2 结果与分析
• 2.1 溶菌酶标准曲线
• 2.2 卵转铁蛋白标准曲线
• 2.3 孵化过程中受精蛋与非受精蛋溶菌酶含量的变化
• 2.4 孵化过程中受精蛋与非受精蛋卵转铁蛋白含量的变化
• 3 结论
• 第六章 结论与创新点
• 1 结论
• 2 实验创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录