血管紧张素Ⅱ-1型受体单核苷酸多态与原发性高血压的相关研究

论文摘要

目的:肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）是体内最重要的血压调节系统,血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang2）Ⅰ型受体（ATI）是肾素-血管紧张素系统重要的组成成分。Ang2主要与AT1受体结合发挥收缩血管和调节醛固酮分泌的作用,从而调节血压和机体的循环血量。基因多态和疾病的连锁分析是目前研究多基因疾病分子生物学基础的常用方法。而单核苷酸多态（single nucleotide polymorphisms,SNP）是基因组中存在最多的多态。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体基因单核苷酸多态与原发性高血压的相关性,在分子生物学水平上探讨高血压病的病因。 方法:（1）选取山东地区原发性高血压患者192名（排除糖尿病和高脂血症患者）为高血压组。随机选择20名高血压患者做为筛查SNP的样本。选取192例无高血压、糖尿病及高血脂血症的正常人为正常血压对照组。两组年龄、体重指数、空酸血糖、总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇、尿素氮、肌苷均没有统计学水平的差异（P>0.05）。高血压组收缩压156±18mmHg,而对照组为113±10mmHg（P<0.01）,高血压组舒张压97±12mmHg,而对照组为74±8mmHg（P<0.01）。（2）DNA提取 用常规酚-氯仿法提取外周血白细胞DNA,用琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度,并标化浓度值至20ng/ul。（3）设计引物 在美国国立生物技术信息中心数据库中获得AT1基因组序列（序列号AF245699）,与其mRNA序列（NM-000685）进行序列对比标出启动子（promoter）区、5’非翻译（5’山东大学硕士学位论文UTR）区、内含子（Intron）区、编码（coding）区和3’非翻译（3’UTR）区。利用Whitehead基因组中心的primer3软件对调控区、外显子和邻近外显子的内含子设计引物进行PCR扩增。（4） PCR反应在96孔板上进行,采用25ul反应体系,其中包括人基因组20ng,10xPCR缓冲液2.5ul,25mmol/LMC122ul,10mmol/L,dNTPO.5ul,10umol/L引物0.8ul,SU/uLTaqDNA聚合酶0.2ul,PCR仪为GeneAmp970OPCR仪。PCR反应条件为Touehdown程序预变性95oCZmin,94oC变性305,退火温度在起始的10个循环中为63℃一58℃,每次递减0.5℃,反应605,延伸72℃405,在以后的30个循环中,退火温度固定为58℃,每次反应405,最后延伸7min以终止所有反应。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。 （5）SNP的发现和检测PCR扩增的目的片段经树脂（wizard PCR PrepsDNApurifieation resin,Promega）纯化后,用ABI一PRISM‘.Big一Dye末端标记试剂盒（PE,Foster City,CA）,以PCR引物为测序引物进行双向测序反应。测序反应条件为96℃变性105,50℃退火55,60℃延伸4 min,35个循环。产物经乙醇沉淀,ABI377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序,进一步用 Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。（6）SNP的基因分型:对具有SNP片段在192个高血压和192个对照中进行扩增,直接测序,用Polyphred软件读出每一个每个样本的基因型。（7）统计学分析采用SAS统计学软件对两组进行病例对照分析,组间比较采用x2检验,P<0.05认为有统计学差别。 结果:ATI基因中共检测出11个SNP,其中G 1 65T和G250T是本研究首次报道,NCBISNP数据库中还没有收录。对其中8个频率大于5%的SNP在192个高血压病人中和192个正常血压对照组中进行基因分型,显示G一521T多态 （rs 1 492078）在原发性高血压患者中T等位基因的频率是29.4%,而对照组中T等位基因频率为21.1%,其分布在两组中有显著统计学意义上的差别,P(0. 01,而以前被广泛研究的All“C多态（rs5186）则没有显示有统计学意义的差别。结论:血管紧张素n一I型受体基因:51492078多态可能与山东地区高血压病发病有一定相关性,由于本研究样本少需要更多的样本和更多的实验证据证实本结论。 关键词:血管紧张素n一I型受体单核普酸多态原发性高血压

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 综述一
• 综述二
• 附录
• 参考文献
• 学术论文