蜡梅ABC转运蛋白基因CpABC的克隆与功能的初步分析

论文摘要

ABC转运蛋白（ATP-Binding Cassette transporter, ABC transporter）是一种广泛存在于原核生物以及真核生物中的一类超级大家族蛋白,是目前已经研究的功能最广泛、蛋白数量最多的一种。它主要作为一种跨膜蛋白存在于生物膜上。近几十年来,人们发现ABC转运蛋白在很多生物中（包括原核和真核生物）会参与一些重要的生理过程,例如植物体内次生产物的代谢过程、细菌的耐药性过程,甚至人体内一些肿瘤细胞的抗药性过程都有非常密切的联系,因而具有重要的研究价值,于是,人们开始广泛关注和研究ABC转运蛋白。蜡梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）原产中国,是第三纪孑遗植物和中国国家二级珍稀濒危植物。12月至翌年早春2月孕蕾开花,于数九寒天,傲然开放于凛冽霜风中,为典型的“冬花”植物,素有“三耐”（耐寒、耐旱、耐剪）与“三不”（冻不坏、旱不死、不缺枝）的称誉,耐寒力极强是蜡梅的最大特点,只要不低于-15℃均能露地安全越冬。本论文从蜡梅花器官中克隆到一个ABC转运蛋白基因CpABC并在大肠杆菌中表达,然后对表达产物进行分析,取得主要结果如下：1.蜡梅ABC转运蛋白基因的克隆通过随机挑选蜡梅cDNA文库测序,获得了大小为707bp的EST序列,然后通过hiTAIL-PCR、RACE等技术克隆出cDNA全长。BLASTX比对结果显示,其与ABC转运蛋白具有很高的同源性,初步推定所获得的cDNA编码ABC转运蛋白,命名为CpABC。CpABC cDNA全长2818bp,其中含有2145bp的开放阅读框,编码蛋白长714个氨基酸。2.植物表达载体的构建将CpABC ORF框片段连接到pMD-19T载体上,然后用BamHI和SacI分别双酶切克隆载体和表达载体pCAMBIA2301g,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建了含有目的基因的表达载体。3.原核表达载体构建设计带BamW I和SacI酶切位点的引物,PCR扩增蜡梅CpABC基因,用BamW I和SacI分别双酶切蜡梅CpABC基因和原核表达载体PET-28a,然后将蜡梅CpABC基因连接到原核表达载体PET-28a上,经过酶切、PCR验证和测序,表明已经成功构建了含有目的基因的原核表达载体。4.CpABC基因在大肠杆菌中的诱导表达将构建好的原核表达载体转入大肠杆菌中,通过合适的诱导条件,诱导CpABC基因在Transetta （DE3）菌株中表达,并通过SDS-PAGE检测重组蛋白证明了CpABC基因的表达。5.CpABC基因的表达分析CpABC在花芽期时表达量最少几乎没有,在花蕾时期表达量随有增加但还是很少,到露瓣时期表达量较高然后初开、盛开时期依次减少,最后在衰败时期表达量最高。CpABC在外瓣中的表达量最高,然后从中瓣、内瓣、雄蕊、雌蕊依次降低,这显示CpABC与蜡梅的生长活动息息相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 植物ABC转运蛋白研究进展
• 1.1.1 ABC转运蛋白的结构
• 1.1.2 ABC转运蛋白的三维结构
• 1.1.3 ABC转运蛋白的作用机理
• 1.1.4 植物ABC转运蛋白分类
• 1.2 蜡梅简介
• 1.3 实时荧光定量PCR
• 1.3.1 实时荧光定量PCR的定义和主要工作原理
• 1.3.2 实时荧光定量PCR过程中涉及的概念
• 1.3.3 实时荧光定量PCR过程中的数学理论
• 1.3.4 实时荧光定量PCR中的常用方法
• 1.3.5 实时荧光定量PCR的应用
• 第2章 引言
• 2.1 研究背景和意义
• 第3章 CpABC基因的克隆与分子特性
• 3.1 技术路线
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 蜡梅花cDNA文库
• 3.2.2 菌株与载体
• 3.2.3 主要仪器及化学试剂
• 3.2.4 自配主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蜡梅DNA提取（CTAB法）
• 3.3.2 蜡梅DNA初提物纯化
• 3.3.3 蜡梅RNA提取
• 3.3.4 蜡梅cDNA一链的合成
• 3.3.5 利用hiTAIL-PCR扩增5'中间片段
• 3.3.6 CpABC基因5'RACE模板合成（SMARTerTM RACE cDNA Amplification）
• 3.3.7 利用5'RACE克隆CpABC基因5'端cDNA序列
• 3.3.8 CpABC基因克隆
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 蜡梅CpABC基因的克隆
• 3.4.2 蜡梅ABC基因编码蛋白的生物信息学分析
• 3.5 讨论
• 第4章 原核表达载体和植物表达载体的构建
• 4.1 技术路线
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株与载体
• 4.2.2 主要仪器及生化试剂
• 4.2.3 常用溶液配方
• 4.2.4 常用培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 原核表达载体的构建
• 4.3.2 CpABC蛋白诱导表达
• 4.3.3 植物表达载体的构建
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 原核表达载体的构建
• 4.4.2 重组质粒pET-28a/ABC在Transetta（DE3）中的诱导表达及检测
• 4.4.3 CpABC基因植物表达载体的构建
• 4.5 结论
• 4.5.1 关于CpABC蛋白的原核表达
• 4.5.2 原核表达菌株的选择
• 第5章 CpABC基因在蜡梅花朵不同组织和不同时期表达的荧光定量分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料及生长条件
• 5.1.2 主要试剂和设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成
• 5.2.2 CpABC基因在蜡梅花不同组织及不同时期表达的荧光定量分析
• 5.3 实验结果与分析
• 5.3.1 总RNA提取
• 5.3.2 引物扩增特异性检测
• 5.3.3 熔解曲线分析
• 5.3.4 标准曲线分析
• 5.3.5 蜡梅CpABC基因在蜡梅花朵不同时期及不同组织中的荧光定量分析
• 5.4 结论
• 第6章 讨论
• 6.1 关于CpABC基因克隆
• 6.2 生物信息学分析基因功能的必要性
• 6.3 关于CpABC基因的原核表达及植物表达载体的构建
• 6.4 CpABC基因在蜡梅花的不同花期、不同器官的表达特性分析
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 发表的论文