拟南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移动能力研究

论文摘要

拟南芥开花诱导基因网络主要是通过光周期途径（photoperiod pathway）、春化途径（vernalization PathWay）、自发途径（autonomous pathway）和赤霉素途径（GA pathway）等4个途径进行的，有很多相关基因起作用，其中拟南芥FLOWERING LOCUS T（FT）基因在其成花信号基因网络中起很重要的整合作用，在光周期诱导途径中，拟南芥叶片中光受体与相关感光节律基因构成的生物节律钟感受光周期信号，调控CONSTANS（CO）基因节律表达，CO基因在合适光周期调控下，将开花信号传导至FT基因，引起叶片中FT基因表达，FT基因表达产物、FT mRNA单独或相互作用，经韧皮部长距离运移到顶端分生组织，调节下游分生组织及花器官决定基因形成花芽开花。FT基因在光周期及其它开花诱导途径中起开花信号关键整合作用，也是现在已知在叶片中感受开花信号而长距离作用于顶端分生组织的基因。本试验对拟南芥FT基因的研究取得了如下研究结果：1．采集16h长日照条件下始花期野生型拟南芥叶片为样本，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，利用RT-PCR法成功克隆得到拟南芥开花诱导遗传网络中关键的枢纽基因FLOWERING LOCUST（FT），分析得到完整FT基因阅读框序列，完整阅读框架长度为528bp，经与NCBI GeneBank数据库比对序列完全正确。2．利用植物病毒载体PVX（Potato Virus X），将FT基因和FT起始子突变为终止子（TAG）的基因序列mFT连接到PVX的基因组中，人工接种烟草，成功侵染烟草的后均在烟草细胞中检测到了复制出的FT RNA和mFT RNA，其中FT RNA成功诱导了短日照品种烟草（Maryland Mammoth）在长日照条件下开花。研究证明了FT基因作为开花诱导途径重要整合基因的生物功能及其开花诱导遗传保守性，探索了利用病毒载体表达外源基因验证基因功能的方法。3．进一步研究FT mRNA长距离运移的能力，利用植物病毒载体TCV（TurnipCrinkle Virus）载体，将刀基因序列连接到TCV△CP（去除病毒壳蛋白编码的TCV）的基因组上，体外转录成TCV△CP-FL、TCV△CP-mFT RNA，接种到拟南芥野生种和突变体ft-1叶片上，利用TCV△CP在拟南芥细胞中的侵染及复制特性，在拟南芥接种叶片细胞中转录出FT mRNA和mFT mRNA，接种7天后，采用RT-PCR法检测未接种新生上部叶片及芽，发现FT mRNA和mFT mRNA能够在新生叶片及新芽中检测到，并且在芽中检测条带要强于下层叶片，说明由没有系统侵染能力与长距离移动能力的TCV△CP介导表达的FT mRNA和mFT mRNA能够在拟南芥植物体内长距离向上移动，并有助于恢复TCV△CP病毒长距离移动能力，由试验结果可以推测FT mRNA参与传导开花诱导信号的可能性。4．通过分割mFT序列，将mFT序列DNA片段分为8段，分别在mFTn（n=1，2，3，4，5，6，7，8），分别连入PVX△CP载体中，构建PVX△CP-mFTn，经体外转录，用其在人工侵染烟草的试验中，采用RT-PCR法没有在接种叶片外检测到PVX△CP-mFTn人工侵染形成的RNA序列片段，说明在人为选择的分割点上形成的8个片段序列，由病毒复制系统产生mFTn RNA在烟草未接种叶片中不具有移动能力，也说明mFT RNA经分割后，可能会失去移动的能力。5．采用生物信息学手段，利用结构分析软件分析FT mRNA的二级结构，分析可能导致其移动的结构基础，以及其结构中可与蛋白结合的结构位点与特别序列结构，分析结果表明FT mRNA二级结构中有稳定的二级结构，有可能是与蛋白结合或作用的特殊结构，这些结果提供了进一步寻找FT mRNA具有系统移动能力结构域的研究方向。研究证明拟南芥FLOWERING LOCUS T（FT）基因的开花诱导生物功能，证明FT基因高等植物间的遗传保守性，同时初步证明FT mRNA在拟南芥中具有的长距离移动能力，能为开花诱导本质作用机理及开花诱导物质探寻打下基础，也探索了采用病毒载体研究开花机理问题以及外源基因表达问题的试验方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 高等植物成花机理研究
• 1.1.1 高等植物成花转换
• 1.1.2 高等植物的成花诱导因素
• 1.2 拟南芥等高等植物成花分子机理
• 1.2.1 拟南芥等高等植物成花机理
• 1.2.2 光周期途径（Photoperiod Pathway）
• 1.2.3 春化途径（Vernalization Pathway）
• 1.2.4 自主促进途径（Autonomous Pathway）
• 1.2.5 赤霉素途径（Gibberellic Acid Pathway,GA Pathway）
• 1.2.6 各途径之间信号整合
• 1.2.7 开花抑制基因
• 1.2.8 MADS盒控制因子
• 1.2.9 开花过程基因的保守性
• 1.3 FT（FLOWERING LOCUS T）基因及其在开花网络调控中的作用及其功能
• 1.3.1 FT基因在开花基因网络中的重要作用
• 1.3.2 FT基因生物功能机理研究
• 1.3.3 FT基因与SOC1基因在开花网络调控中的位置
• 1.3.4 FT mRNA作为开花信号功能的研究
• 1.4 FT基因作用机理研究面临的问题
• 1.5 本研究选题的意义与研究方法
• 1.5.1 本研究选题的意义
• 1.5.2 植物病毒载体的应用
• 1.5.3 试验进行技术路线及研究条件
• 第二章 拟南芥Flowering Locus T（FT）基因克隆
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果与检测
• 2.2.1 总RNA提取结果
• 2.2.2 cDNA质量Actin引物PCR检测电泳结果
• 2.2.3 FT基因DNA电泳结果
• 2.2.4 FT基因功能阅读框架序列测序结果
• 2.3 分析与讨论
• 2.3.1 保证植物样品中FT表达最高峰时采集样品
• 2.3.2 保证植物总RNA质量
• 2.3.3 cDNA质量检测
• 2.3.4 RT引物的选择
• 2.3.5 RT-PCR应用讨论
• 第三章 PVX介导的拟南芥FT基因诱导烟草开花试验研究
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 试验结果与检测
• 3.2.1 接种后烟草叶片病毒侵染状态
• 3.2.2 接种后烟草生长发育状态
• 3.2.3 接种后烟草开花对比结果
• 3.2.4 试验分析
• 3.3 分析与讨论
• 3.3.1 试验操作重点步骤
• 3.3.2 试验结果讨论与分析
• 第四章 拟南芥FT基因mRNA细胞间移动机制研究
• 4.1 试验材料及方法
• 4.1.1 研究材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2.试验结果与检测
• 4.2.1 重组子克隆菌株PCR筛选
• 4.2.2 拟南芥叶片样品RT-PCR签定
• 4.3 分析与讨论
• 4.3.1 试验操作方法讨论
• 4.3.2 试验结果讨论与分析
• 第五章 拟南芥FT基因功能区域研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 试验结果与检测
• 5.2.1 mFTn片段电泳结果
• 5.2.2 重组子电转化及涂平板结果
• 5.2.3 重组子筛选
• 5.2.4 去除CP后PCR筛选
• 5.2.5 构建结果测序
• 5.2.6 接种烟草及样品采集
• 5.2.7 接种烟草叶片样品RT-PCR分析结果
• 5.3 分析与讨论
• 5.3.1 试验操作方法讨论
• 5.3.2 试验结果讨论与分析
• 第六章 FT mRNA序列生物信息分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 核酸序列一、二级结构模拟应用软件
• 6.1.2 FT基因序列蛋白结构信息比较工具
• 6.2 分析结果
• 6.2.1 FT mRNA二级结构软件模拟结果
• 6.2.2 FT mRNA二级结构模拟结果分析
• 6.2.3 FT蛋白结构三维构象
• 6.3 讨论
• 6.3.1 FT mRNA二级结构模拟过程中的问题
• 6.3.2 模拟FT mRNA二级结构分析其移动能力方法评估
• 6.3.3 FT mRNA二级结构分析研究的展望
• 第七章 研究展望
• 7.1 研究结论
• 7.2 研究展望
• 7.2.1 FT基因生物功能的广泛应用
• 7.2.2 FT基因作用机理及信号传导网络地位
• 7.2.3 FT蛋白功能及作用机理
• 7.2.4 病毒载体的应用前景
• 7.2.5 研究植物中RNA系统运移的意义
• 7.2.6 生物大分子空间结构计算模拟应用
• 参考文献
• 致谢
• 附件
• 个人简介