人成纤维细胞生长因子21和融合蛋白E4F21的重组构建与表达研究

论文摘要

目的：在大肠杆菌中可溶性表达并制备重组人成纤维细胞生长因子21,并以此为基础,研究融合蛋白E4F21的重组表达方法。方法：全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,转化大肠杆菌BL21（DE3） Star PlysS,分别以37℃、32℃、23℃作为诱导温度,并改变诱导时间等条件来确定重组人FGF-21的可溶性高效表达方法。表达产物通过盐析、层析等方法提高其纯度后,进行理化性质鉴定。在体外活性实验中,本研究利用小鼠3T3-L1细胞来证明重组人FGF-21促进细胞对葡萄糖摄取的生物学活性。通过PCR技术获得融合蛋白E4F21的cDNA序列,构建不同的表达载体pET-3c-E4F21, pET-32a-EK-E4F21,转化宿主菌BL21（DE3） Star PlysS和W3110,通过改变诱导温度、诱导时间、诱导物、培养基的方法在不同宿主菌中研究融合蛋白E4F21的重组表达。结果：成功构建了重组表达质粒pET-3c-FGF21,转入BL21（DE3） Star PlysS后,确定了在23℃下诱导12小时的表达方法。经SDS-PAGE鉴定,表达产物占菌体总蛋白的20%左右,经表达形式鉴定,重组人FGF-21为可溶性表达。表达产物经纯化回收,纯度达95%以上,质谱测定分子量为19539Da,为Met-FGF-21的形式。在小鼠3T3-L1上开展的体外活性实验结果表明,重组人FGF-21表现出明显的刺激细胞吸收葡萄糖的作用。构建的重组质粒pET-3c-E4F21、pET-32a-EK-E4F21经DNA测序完全正确,并成功转化两种宿主细胞。工程菌在不同条件下的诱导表达结果显示,外源融合蛋白E4F21未能成功表达；在含有葡萄糖的培养基中,不同工程菌经诱导后均伴随着菌体死亡现象的发生。结论：首次实现了重组人成纤维细胞生长因子21在大肠杆菌中可溶性高效表达,为重组人FGF-21的制备建立了更加合理、简便的方法；给融合蛋白E4F21的重组表达及其化学偶联研究提供了重要依据,也为相关后续研究和药物开发奠定了基础。融合蛋白不能在大肠杆菌中表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景及意义
• 1.2 研究现状
• 1.2.1 FGF-21研究进展
• 1.2.2 GLP-1及其类似物Exendin-4研究进展
• 1.3 立题依据与研究目的
• 1.4 研究内容与技术路线
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 重组人成纤维细胞生长因子21的重组构建与可溶性表达
• 2.1 重组质粒pET-3c-FGF21的构建
• 2.1.1 材料及仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 结果
• 2.2 重组人FGF-21在大肠杆菌中的表达
• 2.2.1 引言
• 2.2.2 材料及仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.4 结果
• 2.2.5 小结
• 2.3 重组人FGF-21的制备
• 2.3.1 材料及仪器
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.3 结果
• 2.3.4 小结
• 2.4 重组人成纤维细胞生长因子21理化性质研究
• 2.4.1 材料及仪器
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.3 结果
• 2.4.4 小结
• 2.5 本章小结
• 第三章 融合蛋白E4F21的重组构建与表达
• 3.1 融合蛋白E4F21基因设计
• 3.2 重组表达载体的构建
• 3.2.1 材料及仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果
• 3.3 融合蛋白E4F21的原核表达
• 3.3.1 宿主菌的选择
• 3.3.2 材料及仪器
• 3.3.3 实验方法
• 3.3.4 结果
• 3.4 本章小结
• 第四章 结论及展望
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 附录