球药隔重楼甾体皂甙生物合成相关功能基因的克隆与组织表达分析

论文摘要

甾体皂甙是一类药用价值较高的次生代谢产物,探索和研究它的合成途径,并实现其代谢调控,对促进中医药现代化发展具有重大意义。球药隔重楼（Paris fargesii Franch）是百合科重楼属的一种,它具有清热解毒、止血、止痛的功效,主要药效成分是甾体皂甙。甾体皂甙是通过甲羟戊酸途径合成的,而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是该途径的第一个限速酶。本论文首次成功提取了球药隔重楼的总RNA,通过比对其他种属HMGR基因,找出它们的同源保守序列,扩增出目的基因的保守片段、3’和5’cDNA拼接,克隆得到了HMGR的全长cDNA,命名为PfHMGR,大小为1973 bp,编码576个氨基酸。PfHMGR的生物信息学分析显示,其蛋白分子量约为61 kDa,理论等电点为6.64,与其他植物的HMGR基因具有较高的同源性,有两个HMG-CoA结合位点和两个NADP（H）结合位点,包括两个跨膜区域和三个催化区域。本论文首次构建了PfHMGR基因的大肠杆菌表达载体并将其转化到大肠杆菌中表达,其表达鉴定结果显示PfHMGR能够替代AtIPI基因的功能,促进了类胡萝卜素的积累,即PfHMGR在大肠杆菌中实现了表达。以18S基因作为内参照,采用Real-time PCR方法扩增了甾体皂甙的生物合成途径中其他三个功能基因IPPI、FPS、SS的部分序列,研究了它们在不同组织中的表达差异,结果显示这三个基因在根、茎、叶中均有表达。IPPI在茎中的表达量最高,根中最低,FPS也是在茎中表达量最高,叶子中最低,而SS在根中的表达量最高,叶中最低。另外,通过one-step PCR检测出PfHMGR基因在根、茎、叶三个组织部位都有表达,但在根中的表达量高于茎中的表达量,而叶中的表达量最低。PfHMGR这样的表达差异很有可能与根部的生长以及甾体皂甙的积累成正相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 药用植物次生代谢的分子研究
• 1.1.1 药用植物次生代谢及产物的简介
• 1.1.2 药用植物次生代谢机制的研究热点
• 1.1.3 重楼属植物次生代谢途径功能酶的研究
• 1.2 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的研究进展
• 1.2.1 HMGR的结构与功能研究
• 1.2.2 HMGR的反馈调节研究
• 1.2.3 HMGR基因的研究
• 1.3 RACE技术在植物功能基因上的研究进展
• 1.3.1 RACE技术的原理
• 1.3.2 RACE技术的关键环节
• 1.3.3 RACE在植物基因克隆上的应用现状
• 1.4 本论文的研究目的和内容
• 1.4.1 本论文的研究目的
• 1.4.2 本论文的研究内容
• 1.4.3 本论文课题资助情况
• 第二章 球药隔重楼HMGR功能基因基于RACE技术的cDNA克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要试剂和仪器
• 2.2.2 样品来源
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 RNA浓度、纯度检测及纯化与反转录
• 2.3.3 功能基因HMGR保守片段的克隆
• 2.3.4 球药隔重楼HMGR基因3’端的克隆
• 2.3.5 球药隔重楼HMGR基因5’端的克隆
• 2.3.6 球药隔重楼HMGR基因全长序列的获得
• 2.3.7 核酸与蛋白序列分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 球药隔重楼总RNA质量检测
• 2.4.2 球药隔重楼HMGR基因同源片段的检测
• 2.4.3 3'端和5'端RACE及全长序列结果
• 2.4.4 球药隔重楼HMGR基因生物信息学分析
• 2.5 本章小结
• 第三章 HMGR基因的组织表达模式分析以及在大肠杆菌中的表达鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 工具酶
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 主要试剂的配制
• 3.2.5 仪器与设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 HMGR基因编码序列的扩增
• 3.3.2 纯化后的HMGR cDNA与pTrc-AtIPI质粒的双酶切
• 3.3.3 酶切后回收的HMGR cDNA和载体pTrc的连接及载体的自连
• 3.3.4 质粒的转化
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 不含信号肽的PfHMGR基因的PCR扩增结果
• 3.4.2 重组表达载体pTrc-PfHMGR的构建
• 3.4.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.4.4 重组质粒pTrc-PfHMGR的序列测定
• 3.4.5 pTrc-PfHMGR在大肠杆菌中表达的颜色鉴定结果
• 3.5 本章小结
• 第四章 球药隔重楼功能基因的组织表达模式分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 植物样本
• 4.2.2 实验仪器和试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 RNA的提取和浓度检测
• 4.3.2 引物设计
• 4.3.3 四个基因的PCR扩增及产物的纯化与测序
• 4.3.4 实时荧光定量RT-PCR
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 样品RNA及反转录的cDNA检测
• 4.4.2 IPPI、FPS、SS基因RT-PCR及测序结果
• 4.4.3 IPPI、FPS、SS基因Real-time PCR扩增曲线及熔解曲线分析
• 4.4.4 球药隔重楼不同组织IPPI、FPS、SS基因的表达分析
• 4.4.5 HMGR功能基因的组织表达结果分析
• 4.5 本章小结
• 第五章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间研究成果