流感病毒裂解疫苗工艺研究

论文摘要

流感病毒具有高度的传染性,能引起急性呼吸道传染疾病,流行特点是在短时间内突然爆发,迅速蔓延,造成不同程度的流行,包括世界大流行、局部流行暴发及扩散。其发病率极高,同时伴有很高的死亡率。目前尚无特效药,接种流感疫苗是被公认的预防流感发生与传播的最佳方法,用鸡胚作为病毒生长介质也是目前流感疫苗生产最常用的培养基质。我们首先将来源于WHO流感参考和研究合作中心的H1N1、H3N2、B三种不同型别的流感病毒毒株分别接种于SPF级鸡胚,经培养后,收获其尿囊液,制备主代和工作种子批。将工作种子批接种来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群鸡胚进行大规模培养,收获病毒液,然后经超滤浓缩、纯化、裂解、灭活、二次纯化等步骤,获得三个型别的单价病毒液。在这过程中首先明确了适宜的毒种稀释倍数和病毒收获时间,然后摸索了蔗糖密度梯度离心纯化应该收集的病毒峰,并对工艺中裂解剂以及灭活剂的选用进行了研究,确定了生产工艺。选用两种裂解剂Triton X100和Triton N101,以不同浓度对流感病毒单价纯化液作用,通过电镜进行裂解效果观察,确定最佳裂解时间,用单向免疫扩散法检测HA含量作为评价指标。结果表明:Triton X100的裂解效果较优越,0.5%～1%,Triton X100作用90min可使流感病毒裂解。我们在本次研究中,将二乙烯亚胺（Binary Ethylene Imine,简称BEI）引入制备流感病毒灭活疫苗当中,与甲醛做对照,BEI的最佳灭活时间在24～36h之间,甲醛的为3h;BEI的灭活后的免疫效果明显优于甲醛。运用RT-PCR的方法测定出病毒8个基因灭活前后的变化,表明BEI灭活病毒的同时将8个基因序列完全破坏,而甲醛破坏不完全,从分子生物学水平证明经BEI灭活的流感灭活疫苗更加安全、可靠。通过单向免疫扩散试验对两种灭活剂的灭活效果做进一步验证,发现虽然BEI灭活病毒的时间长,但是其样品中HA含量较甲醛灭活的高,但BEI能否用于人用疫苗的制备还需进一步研究进行大量的临床实验。本研究对使用鸡胚培养流感病毒制备流感裂解疫苗生产工艺的几个重要环节进行试验摸索,为将来生产工艺的进一步改进提供了研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、材料和方法
• （一）、实验材料
• （二）、实验方法
• 1、流感病毒种子批制备
• 2、流感病毒的培养和收获
• 3、流感病毒液澄清和超滤浓缩
• 4、流感病毒液区带离心纯化
• 5、流感病毒液的裂解
• 6、流感病毒液的灭活
• 7、裂解灭活病毒液二次区带离心纯化
• 8、流感纯化液的除菌过滤
• 9、单价苗检定
• 二、结果和分析
• 三、讨论
• 四、小结
• 参考文献
• 论文综述
• 附录
• 致谢
• 研究生简历