论文摘要
褶纹冠蚌（Cristaria plicata）是我国重要的“淡水育珠蚌”之一,由于褶纹冠蚌容易感染蚌病,给其育珠能力产生了较大的影响。本文对褶纹冠蚌α2巨球蛋白基因的进行了克隆,并对其部分序列进行了表达。根据α2巨球蛋白基因（alpha-2Macrogloblin,α2M）序列同源性资料,利用简并引物RT-PCR、PCR Walk和5’RACE和3’RACE方法克隆出褶纹冠蚌α2M全长。该基因全长5621bp,其中编码区5226 bp,5’端不翻译区32bp,3’端不翻译区363 bp（含ployA尾31bp）。基因序列开放阅读框编码1741个氨基酸,其中前16个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白含1725个氨基酸残基,分子量为195 KDa,等电点为5.12,并含有7个N-link的糖基化位点。褶纹冠蚌与其它动物α2M基因一样含有三个功能区:诱饵区（bait region）,内部硫酯键（internal thiol ester）和受体结合区（receptor-binding domain）。经序列比对和系统发育树分析表明褶纹冠蚌与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和栉孔扇贝（Chlamys ferrari）的α2M基因具有非常高的同源性。利用RT-PCR分析检测α2M基因在褶纹冠蚌不同组织的表达情况,结果发现α2M仅在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肝胰腺和性腺中没有表达。注射嗜水气单胞菌6,12,24 h后,褶纹冠蚌体内α2M的表达水平有一定量的升高,证明α2M是褶纹冠蚌基础免疫系统中的重要组成部分。选择褶纹冠蚌α2M基因包含有受体结合区片段的第1138-1606氨基酸设计含有酶切位点的表达引物,构建重组表达质粒,经过IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明重组的α2M在大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta-gami（DE3）中获得了表达,产物为69KDa的融合蛋白。
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摘要ABSTRACT缩略语表目录第1章 引言1.1 贝类免疫研究概述1.2 贝类的细胞免疫1.3 贝类的体液免疫1.3.1 水解酶类1.3.2 氧化酶1.3.3 抗菌肽1.3.4 凝集素1.3.5 溶血素及其它2-巨球蛋白'>1.3.6 α2-巨球蛋白2M的分子结构'>1.3.6.1 α2M的分子结构2M的生物合成'>1.3.6.2 α2M的生物合成2M与受体的结合作用'>1.3.6.3 α2M与受体的结合作用2M与细胞因子的结合'>1.3.6.4 α2M与细胞因子的结合2M与补体因子的关系'>1.3.6.5 α2M与补体因子的关系2M分子克隆及研究进展'>1.3.6.6 α2M分子克隆及研究进展1.4 本研究的目的和意义2巨球蛋白基因的分子克隆与表达'>第2章 褶纹冠蚌α2巨球蛋白基因的分子克隆与表达2.1 材料与方法2.1.1 主要仪器设备2.1.2 主要试剂2.1.3 试验材料2.1.4 试验方法2.1.4.1 RNA的提取2.1.4.2 SMART cDNA的合成2M基因受体结合区片段的克隆'>2.1.4.3 褶纹冠蚌α2M基因受体结合区片段的克隆2M基因5'Ⅰ区片段的克隆'>2.1.4.4 褶纹冠蚌α2M基因5'Ⅰ区片段的克隆2M基因5'Ⅱ区片段的克隆'>2.1.4.5 褶纹冠蚌α2M基因5'Ⅱ区片段的克隆2M基因3'末端及5'末端克隆'>2.1.4.6 褶纹冠蚌α2M基因3'末端及5'末端克隆2.1.4.7 测序及序列分析2M基因在不同组织的表达分析'>2.1.4.8 褶纹冠蚌α2M基因在不同组织的表达分析2M基因在嗜水气单胞菌刺激后的表达分析'>2.1.4.9 褶纹冠蚌α2M基因在嗜水气单胞菌刺激后的表达分析2M基因片段的原核表达'>2.1.4.10 褶纹冠蚌α2M基因片段的原核表达2.2 结果2.2.1 褶纹冠蚌血细胞中总RNA的纯度2M基因受体结合区片段的克隆'>2.2.2 褶纹冠蚌α2M基因受体结合区片段的克隆2M基因5'Ⅰ区片段的克隆'>2.2.3 褶纹冠蚌α2M基因5'Ⅰ区片段的克隆2M基因5'Ⅱ区片段的克隆'>2.2.4 褶纹冠蚌α2M基因5'Ⅱ区片段的克隆2M基因3'末端及5'末端克隆'>2.2.5 褶纹冠蚌α2M基因3'末端及5'末端克隆2M基因序列拼接及序列信息'>2.2.6 褶纹冠蚌α2M基因序列拼接及序列信息2M基因功能区域'>2.2.7 褶纹冠蚌α2M基因功能区域2M基因氨基酸序列系统发育分析'>2.2.8 褶纹冠蚌α2M基因氨基酸序列系统发育分析2M基因在不同组织中的表达'>2.2.9 褶纹冠蚌α2M基因在不同组织中的表达2M基因在嗜水气单胞菌后的表达'>2.2.10 褶纹冠蚌α2M基因在嗜水气单胞菌后的表达2M基因部分片段在大肠杆菌中的表达'>2.2.11 褶纹冠蚌α2M基因部分片段在大肠杆菌中的表达2.3 讨论第3章 结论与展望3.1 结论3.2 展望致谢参考文献攻读学位期间的研究成果
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