论文摘要
正常角膜构成眼球的第一道屏障,完成70%以上的屈光功能,对视觉的形成极其重要。角膜病患病率高,致盲性强,仅次于白内障居世界致盲原因的第二位。据WHO统计,每年约1000万世界人口因角膜病而致盲。同种异体角膜移植是治疗角膜盲患者最有效的方法,但角膜供体来源匮乏使其应用受到限制,角膜供体老龄化及激光手术的开展则使这种情况进一步加剧。积极寻找新的角膜供体代替同种异体角膜是眼科界亟待解决的问题。应用组织工程技术构建角膜旨在为角膜病的治疗提供较好的材料来源,是目前全球眼科界研究的热点。而选择合适的支架材料则是构建组织工程角膜的瓶颈。本研究应用不同的理化方法脱细胞处理异种（猪）角膜,选择脱细胞效果彻底且能完整保留组织结构的标本行组织学（光镜/电镜/免疫组化）、生物化学、生物力学等检测以筛选制备异种脱细胞角膜基质的最佳方案,继之通过生物相容性及生物安全性的检测验证其作为组织工程角膜载体材料的可行性,初步行细胞接种为组织工程角膜的三维构建提供可靠的实验依据和理论基础。第一部分异种脱细胞角膜基质的制备目的:比较不同理化方法对异种角膜的脱细胞效果;筛选制备异种脱细胞角膜基质的最佳方法并检测其生物学性能,为组织工程化人工角膜的构建提供理想的载体材料。方法:1.应用不同的去污剂及反复冻融法对猪角膜进行脱细胞处理:（1）0.25%、0.5%、1%、2%、5%Triton X-100各自分别处理12h、24h、36h、48h、72h、96h;（2）0.1%、0.25%、0.5%、1%SDS;（3）0.25%、0.5%、1%SDS;（4）0.5%、1%CHAPS;（2）（3）（4）组各浓度分别处理12h、24h、36h、48h;（5）反复冻融:-80℃分别冷冻2h、24h、24h×3,室温融化1h。通过大体形态、组织学检查初步评价各种方法的脱细胞效果。选择脱细胞效果彻底、组织学结构完整的标本进行生物力学性能检测,并以新鲜猪角膜作对照,筛选出生物力学性能良好的方法。2.应用1筛选的方案脱细胞处理猪角膜,行组织学检查HE染色、特殊染色（VG染色、阿利新兰染色）、免疫组化染色（FN、LN、Ⅰ型及Ⅳ型胶原、a-SMA、a-gal）进一步检测脱细胞的效果及角膜基质结构成分保留的程度,行扫描电镜、透射电镜检查脱细胞角膜的超微结构,并应用生物化学的方法检测脱细胞前、后角膜组织的含水量、羟脯氨酸含量、可溶性蛋白及DNA成分的变化。结果:1.脱细胞猪角膜基质水肿混浊、呈半透明状,具有一定的弹性和韧性。组织学检查:（1）同样的处理时间条件下,随着Triton X-100浓度的增加,猪角膜的细胞成分相应减少;特定的作用浓度下,随着处理时间的延长,猪角膜的细胞成分略有减少;即使最高浓度（5%）Triton X-100持续作用96h,仍有较多的基质细胞残留。（2）0.5%及1%SDS处理24h组无基质细胞及细胞碎片残留,胶原纤维排列整齐、规则,保留完整的前、后弹力层;相同浓度处理时间超过24h,前弹力层及部分胶原纤维断裂;低于上述处理浓度及时间,残留部分基质细胞或细胞碎片。（3）SD组随处理浓度的增加及时间的延长,角膜基质细胞逐渐减少,36h仍残留少许基质细胞和细胞碎片,48h胶原纤维结构破坏、前后弹力层消失,同时有细胞碎片残留。（4）CHAPS组随处理浓度的增加,基质细胞减少,1%CHAPS 36h仍残留少许基质细胞且前弹力层部分破损。（5）随着低温冷冻时间的延长,基质细胞逐渐减少,但最大作用时间仍有较多细胞残留且胶原纤维部分断裂。力学检测:0.5%SDS处理24h组的极限抗张强度（3.4775±0.1584 Mpa）与新鲜角膜（4.1750±0.7438 Mpa）相比无统计学差异（P>0.05）,而1%SDS处理24h组（204550±0.2940Mpa）与前两者比较均有统计学差异（P<0.01）。各组的弹性模量及断裂伸长率（%）比较均无统计学差异（P>0.05）。2.0.5%SDS处理24h猪角膜组织学检查:HE染色见角膜组织结构完整,胶原纤维排列整齐,内无细胞及碎片残留;VG染色见基质层胶原纤维呈均质红染;阿利新兰染色见蓝染的纤维状结构;扫描及透射电镜检查未见残存细胞及细胞器碎片,胶原纤维排列规整、超微结构基本同于新鲜猪角膜;FN、LN、Ⅰ型及Ⅳ型胶原的免疫组化染色均呈阳性表达,而a-SMA、a-gal呈阴性表达;DAPI荧光染色阴性。生物化学检测:0.5%SDS处理24h猪角膜的含水量（92.68±0.30%）较新鲜角膜（81.18±1.91%）升高（P<0.05）;羟脯氨酸含量（2.1510±0.1049μg/mg）与新鲜角膜（1.6134±0.0755μg/mg）比较无统计学差异（P>0.05）;可溶性蛋白SDS-PAGE电泳未见明显蛋白质条带;DNA琼脂糖凝胶电泳未见电泳条带。结论:0.5%及1%SDS处理24h均可完全脱除猪角膜的异种细胞成分并保留完整的组织结构,其他处理方法、浓度及时间均无此效果;0.5%SDS处理24h能完全去除猪角膜的异种细胞及其抗原成分,同时保留完整的细胞外基质结构、有效的生化成分及良好的机械力学性能,因而是制备异种脱细胞角膜基质的最佳方法。第二部分异种脱细胞角膜基质生物相容性及生物安全性的研究目的:评价异种脱细胞角膜基质的生物相容性及生物安全性,为组织工程角膜支架材料临床应用的安全性提供可靠的实验依据。方法:1.按照医疗器械生物学评价ISO10993和GB/T16886的标准和要求进行体外细胞毒性试验、急性全身毒性试验、热源试验和体内植入试验。（1）以普通细胞培养液为阴性对照,DMSO为阳性对照,应用CCK-8试剂盒检测异种脱细胞角膜基质浸提液对兔角膜基质细胞的生物学影响;（2）观察异种脱细胞角膜基质浸提液注入鼠尾静脉24h、48h、72h后受试动物的体重变化及生命体征变化;（3）测量异种脱细胞角膜基质浸提液注入兔耳缘静脉后的体温变化;（4）异种角膜基质制备成直径5mm、厚150μm的圆片状,0.5%SDS处理24h并组织学检查验证脱细胞效果后植入兔角膜板层囊袋内。阳性对照组植入新鲜（未脱细胞）角膜基质,空白对照组只制作囊袋。术后每天裂隙灯观察并于术后2w、4w、8w、12w及24w取角膜行组织病理学检查。2.以PK15细胞为阳性对照,应用RT-PCR检测新鲜猪角膜、脱细胞猪角膜及兔角膜板层囊袋植入脱细胞猪角膜基质4w、12w及24w的兔外周血中有无PERV基因的表达。结果:1.异种脱细胞角膜基质浸提液对兔角膜基质细胞的形态及生长状态无明显影响,第1、3、5d细胞相对增殖率分别为:108.36±1.89（%）、122.14±0.13（%）、101.85±0.69（%）;脱细胞角膜基质浸提液对受试小鼠的生命体征无不良影响,体重逐日明显增加,与对照组比较无统计学差异（P>0.05）;脱细胞角膜基质浸提液注入兔耳缘静脉未引起体温的异常变化;脱细胞角膜基质植入组结膜充血、角膜水肿及新生血管程度较新鲜角膜植入组稍重、持续时间稍长,植入材料较早变透明;组织学检查见2种材料植入组局部均无炎症细胞浸润,逐渐与宿主角膜融合生长,术后8w始,宿主基质细胞开始向脱细胞材料边缘移行并逐渐向其内生长。2.脱细胞猪角膜基质、移植脱细胞猪角膜基质4w、12w及24w的兔外周血淋巴细胞均未检测到PERV基因的表达。结论:异种脱细胞角膜基质无细胞毒性、无急性全身毒性、无热源性、植入体内无毒性反应并能促进周围角膜基质细胞的长入,属于无毒级生物材料并具有良好的生物相容性;005%SDS处理24h可以去除异种角膜基质PERV的表达而具有一定的生物安全性;异种脱细胞角膜基质是组织工程角膜构建的理想载体材料。第三部分异种脱细胞角膜基质为载体构建组织工程角膜基质层的实验研究目的:探讨以异种脱细胞角膜基质为载体构建组织工程角膜基质层的可行性,观察脱细胞角膜基质的体外再细胞化情况。方法:采用组织块培养的方法原代培养兔角膜上皮、基质及内皮细胞,观察细胞生长状态并行免疫组化检查鉴定细胞表型。分别采用细胞悬液及基质注射的方式在脱细胞角膜基质表面及内部接种基质细胞,观察细胞的生长情况并行组织学检查。结果:原代培养的兔角膜上皮、基质及内皮细胞保持正常的细胞形态并分别表达角化蛋白（AE5）、波形蛋白（Viminin）及神经纤维丝蛋白（NF）。细胞接种后材料表面有细胞粘附生长,材料内部有细胞聚集生长、分布不均匀。结论:组织块原代培养的方法可以获取保持正常细胞表型的3种角膜细胞;角膜基质细胞与脱细胞猪角膜基质共培养能保持正常的细胞活性与生长状态。需要改进接种方式及培养条件以构建组织工程化的角膜基质层。