论文摘要
第一部分PML Coiled-coil结构域与RANBP9相互作用的验证目的:早幼粒白血病基因的Coiled-coil结构域（PML-C）和Ran结合蛋白9（RANBP9）之间相互作用的体外验证。方法:将pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9中的目的片断PML-C和RANBP9分别亚克隆于真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc里，然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293），最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果:在共转染pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-RANBP9的HEK293细胞组相应80kD大小位置检测出融合蛋白Myc-RANBP9条带。结论:免疫共沉淀实验从体外验证了PML-C和RANBP9之间的相互作用。第二部分RANBP9SPRY结构域介导与PML Coiled‐coil结构域相互作用目的:探讨介导RANBP9与PML-C相互作用的RANBP9结构域。方法：构建表达靶蛋白的pACT2-SPRY及pACT2-LisH-CTLH载体，与表达诱饵蛋白的pGBKT7-PML-C分别共同转入酵母细胞AH109里，培养3到5天后观察是否有蓝色菌落生长；构建真核表达载体pCMV-Myc-SPRY和pCMV-Myc-LisH-CTLH,与pCMV-HA-PML-C分别共转染人胚肾293细胞里（HEK293），利用免疫共沉淀技术对其是否有相互作用进行验证。结果：酵母双杂交试验显示共转化pACT2-SPRY和pGBKT7-PML-C的AH109细胞培养后出现蓝色菌落，而共转化pACT2-LisH-CTLH和pGBKT7-PML-C的AH109细胞培养后未出现蓝色菌落；共转染pCMV-Myc-SPRY和pCMV-HA-PML-C的293细胞经免疫共沉淀、免疫印迹后检测到融合蛋白Myc-SPRY条带，而共转染pCMV-Myc-LisH-CTLH和pCMV-HA-PML-C的293细胞不能在相应位置检测到条带。结论：酵母双杂交试验及免疫共沉淀实验均证明了与PML-C相互作用的RANBP9的结构域是SPRY。第三部分PML-NLS-与RANBP9相互作用的验证目的:早幼粒细胞白血病基因NLS缺失突变体（PML-NLS-）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用的验证。方法:构建真核生物表达载体pCMV-HA-PML-NLS-和pCMV-Myc-RANBP9，然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293），最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果:在共转染pCMV-HA-PML-NLS-和pCMV-Myc-RANBP9的HEK293细胞组相应位置检测出融合蛋白Myc-RANBP9条带。结论:免疫共沉淀实验验证了PML-NLS-与RANBP9体外相互作用第四部分Ran结合蛋白9过表达促进急性早幼粒细胞凋亡目的：研究RANBP9蛋白过表达对急性早幼粒细胞增殖凋亡的影响。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1-RANBP9并转染NB4细胞；利用FCM技术检测RANBP9表达对NB4细胞的凋亡的影响；分光光度法检测Caspase3活性；免疫印迹法分析RANBP9过表达引起Bax、Bc-l2凋亡相关基因蛋白质表达量水平的变化。结果：FCM显示转染pcDNA3.1-RANBP9NB4的ＮＢ４细胞凋亡率增加;分光光度法检测到Caspase3活性明显增强；过表达RANBP9的细胞组Bax蛋白质翻译水平都明显上调，而Bcl-2蛋白质翻译水平明显下降。结论： RANBP9的过表达可导致NB4细胞凋亡，并可能通过与线粒体凋亡途径相关的因子来促进急性早幼粒细胞凋亡的。
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