重组嵌合毒素DAB389-IL2的质粒构建,表达纯化及其mPEG化修饰的研究

重组嵌合毒素DAB389-IL2的质粒构建,表达纯化及其mPEG化修饰的研究

论文摘要

重组嵌合毒素DAB389-IL2 属于免疫毒素,是在白喉毒素的基础上构建的靶向毒素,保留了天然白喉毒素N 端388 位氨基酸,并用人IL2 替代白喉毒素C 端的毒素受体结合区。该分子既具有白喉毒素的杀细胞毒性,又具有结合细胞表面特异性识别IL2 抗体的功能。因此,该药物可以特异性地杀灭IL2高表达的肿瘤细胞,有广阔的开发及应用前景。本研究构建了带有his 标签的DAB389-IL2 白喉毒素表达载体,转化大肠杆菌BL21 菌株,表达并纯化出蛋白,然后对蛋白进行了mPEG 化修饰的研究,测活结果表明所得到的DAB389-IL2 与mPEG 化之后的DAB389-IL2 蛋白均具有特异性杀伤IL2 受体高表达肿瘤细胞的能力。由于DAB389-IL2 蛋白难以纯化且易于降解,本研究提高了该融合蛋白的纯化效率,为国内该药物的开发利用打下良好基础。

论文目录

  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 实验材料
  • 2.1 主要仪器
  • 2.2 实验材料与试剂
  • 2.3 溶液的配制
  • 实验方法
  • 第三章 结果与讨论
  • 3.1 重组质粒的构建
  • 1 PCR 扩增 His6-IL2 基因
  • 2 克隆载体 pcDNAII EcoRV /His6-IL2 的酶切鉴定
  • 3 表达载体 pET-30a/His6-IL2 的酶切鉴定
  • 4 目的片段 DAB389-IL2 与表达载体 pET-28a 的回收结果
  • 5 表达载体 pET-28a /His6-DAB389-IL2 的酶切鉴定
  • 6 重组质粒测序鉴定
  • 3.2 目的蛋白的表达纯化
  • 3.1.1 重组质粒在表达菌 E.coli BL-21 中的诱导表达
  • 3.1.1.1 pET-28a/His6-DAB389-IL2 的诱导表达
  • 3.1.1.2 pET-28a/His6-DAB389-IL2 的诱导表达条件
  • 3.1.1.3 pET-30a/His6-IL2 的诱导表达
  • 3.1.2 His6-DAB389-IL2 的纯化
  • 3.1.2.1 His6-DAB389-IL2 蛋白变性液的制备
  • 3.1.2.2 His6-DAB389-IL2 蛋白金属螯合层析纯化
  • 3.1.2.3 His6-DAB389-IL2 纯化蛋白的鉴定
  • 3.3 DAB389-IL2 蛋白的 mPEG 化修饰
  • 3.1.1 His6-DAB389-IL2 的 mPEG 修饰物的制备
  • 3.3.2 mPEG-his6-DAB389-IL2 的纯化
  • 3.3.3 mPEG-his6-DAB389-IL2 的生物活性测定
  • 参考文献
  • 附录
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 致谢
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