论文摘要
氧化亚铁硫杆菌（Acidothiobacillus ferrooxidans）在浸矿中具有重要地位,它能氧化亚铁、硫和还原态硫化物,而且氧化亚铁硫杆菌也是浸矿细菌研究的模式菌株。关于氧化亚铁硫杆菌铁硫的氧化的研究都已经比较成熟。在实验室前期工作中发现半胱氨酸脱硫酶（cysteine desulfurase IscS）在硫为唯一能源时,该基因表达上调。半胱氨酸脱硫酶（cysteine desulfurase）是一个以5-磷酸吡哆醛为辅基的二聚体酶,该酶可以催化L-型半胱氨酸转变为L-型丙氨酸生成的硫烷通过形成半胱氨酸的过硫化物,从而保护半胱氨酸残基。为研究该蛋白在硫氧化过程中的作用,利用大肠杆菌E. coliBL21（DE3）作为替代宿主,将含半胱氨酸脱硫酶基因的质粒pET-His-IscS,转入E. coli BL21中使其过表达,发现无论是在固体培养基还是液体培养基中pET-His-IscS/BL21菌株的生长速度都比pET-His/BL21菌株的生长速度快。由此可以看出半胱氨酸脱硫酶能够促进大肠杆菌的生长。将pET-His-IscS/BL21菌株和pET-His/BL21菌株分别接种至含硫代硫酸钠（Na2S2O3）的培养基中,发现在加有2.5%的硫代硫酸钠的LB培养基中,pET-His-IscS/BL21菌株能够正常的生长,而对照菌株却不能生长。可以看出该基因在硫的代谢中是有一定的作用的。我们推测在硫的氧化过程中,首先要打开稳定的S8环成线性的无机硫,才能进一步的氧化,而该基因编码的蛋白在催化半胱氨酸脱去硫形成的带有巯基的半胱氨酸残基可以进行亲核攻击硫环从而打开硫环进行下一步氧化。进一步通过免疫共沉淀筛选到与IscS相互作用的蛋白,经质谱鉴定该蛋白为Short-chain dehydrogenases/reductases （SDR）,进一步采用GST-pull down验证了AF3菌IscS与SDR之间确实存在有相互作用。然而随着矿产资源需求量的增加,生物冶金技术对菌的生长温度要求越来越高,因此随之发展起来的中等嗜热菌慢慢占为主导地位。因此本研究对嗜酸硫化芽孢杆菌（TPY）的半胱氨酸脱硫酶（cysteine desulfurase SufS）也采用了同样的研究方法。研究结果发现该酶在大肠杆菌（E. coli）体内过表达后无论是在LB固体培养基还是液体培养基同样也可以促进该菌的生长。且通过western在蛋白分子水平上验证了该蛋白的表达量随着细菌生长的加快而急剧增加。将纯化复性后的SufS蛋白加入LB培养基中也可以促进大肠杆菌的生长。由此可以看出该酶确实是可以促进大肠杆菌生长。在加有3%硫代硫酸钠的LB培养基中,重组菌也是可以正常生长,但是对照菌株却不能生长。这说明该基因在硫的代谢中也是有一定的作用的。且在硫的代谢中的作用机理与IscS蛋白的作用机理相似。在体外通过亚甲基蓝比色法测定了SufS的活性。证明纯化得到的该蛋白在体外是有活性的。也通过免疫共沉淀探讨了在体内与SufS相互作用的蛋白。目前质谱结果还没出来。
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