基于水产品下脚料ACEIP生物法制备及其分离纯化、性质的研究

论文摘要

本论文以水产蛋白下脚料为原料,进行了可控酶解法、复合酶解法、微生物发酵法等生物法制备ACEIP（Angiotensin I Converting Enzyme Inhibitory Peptide）的工艺及条件优化、发酵动力学以及肽的分离纯化、结构测定和功能性质的系统研究。首先,针对海洋鱼类蛋白及其加工下脚料、淡水鱼类蛋白及贻贝类等水产蛋白进行适合于ACE抑制肽生产制备的原料筛选,分析了15种水产蛋白的组成成分,以血管紧张素转换酶半抑制浓度(ACEIC50)为评价指标,比较了酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解效果,筛选出带鱼脊骨作为进一步研究的材料。对带鱼脊骨可控酶解法制备ACE抑制肽的工艺进行研究。分析比较了酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶及弹性蛋白酶对带鱼脊骨的酶解效果,以ACEIC50和抗氧化活性(还原力,OD700)为ACEIP的主要评价指标,从中筛选出酸性蛋白酶为最适酶,并对酸性蛋白酶的酶解条件进行了响应面优化分析,得出了最佳的可控酶解条件为:酶解pH 2.67;酶解温度45℃;时间7h;料水比为1:4.38（m/v,g/mL）;加酶量为1/150（g/g protein）。在此条件下,酶解液的ACEIC50为1.05mg/mL,抗氧化活性(还原力OD700)为0.638。在单酶可控酶解的基础上,进一步研究了复合酶解对带鱼脊骨的酶解效果,以ACEIC50为ACE抑制肽的主要评价指标,通过正交试验优化,得出复合酶解的最适酶组合及酶解条件为:以弹性蛋白酶在温度37℃,pH7.5,料水比1:4.5（m/v,g/mL）,加酶量1/100 g/g protein的条件下水解3小时后,再以胃蛋白酶在相同温度,pH2.0,加酶量1/300g/g protein的条件下水解2小时,在此条件下,酶解液的ACEIC50达到0.88mg/mL。可控酶解法应用于工业生产时会受到酶品种及成本的限制。本论文首次深入研究了微生物发酵法转化带鱼脊骨制备ACEIP的菌种筛选、培养基组成,并利用响应面方法进行了系统优化研究,得到用于转化的最佳菌种为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisEL314CF10）；最适宜的培养条件:蔗糖含量4.42%;带鱼脊骨含量4.39g/25mL;K2HPO40.1%;MgSO40.01%;pH 7.0（灭菌后）;温度37℃;摇床转速200rpm;装液量25mL/250mL摇瓶;种龄18h;接种量4%;培养时间28h。在此条件下,发酵液ACEIC50值可达0.78mg/mL;还原力(OD700)达0.812,接近2mg/mL的抗坏血酸的抗氧化活性。为了将研究成果应用于工业化生产,给生产实际提供基础数据,本论文还利用5L发酵罐进行了微生物发酵动力学的研究,培养条件为:温度37℃,搅拌速率200rpm,通气量1vvm,不控制发酵pH。通过数学分析及计算,得到了底物消耗和产物生成的动力学模型如下:对模型参数进行F检验,显著性均很高（P＜0.01）,即模型在99%的概率水平上是非常显著的,模型计算值与试验值拟合良好,说明模型具有很好的实际应用价值。采用现代分离技术,包括超滤法,层析法及制备刑液相色谱对试验得到的多肽混合物进行了分级分离纯化。带鱼脊骨生物活性肽的活性成分集中在分子量小于5000Da的组分。对这部分多肽混合物进行了凝胶色谱分离,得到了14个峰,以酪氨酸为标准物质标定了分离组分峰的分子量,发现,ACE抑制肽集中在分子量较小（主要1000Da以下）的组分；而抗氧化活性集中在分子量稍大（500-3000Da）的多肽组分。对ACE抑制活性最高的峰进行了进一步纯化,最后得到了纯度和活性均很高的单组分ACE抑制肽。利用液质联用法测定了ACE抑制肽的表观分子量为317.25,进而利用氨基酸N-端测序技术测定了得到的该肽氨基酸一级结构为LW,其ACEIC50为5.6μM。在对带鱼脊骨ACE抑制肽进行了分离纯化和性质研究的基础上,为了进一步验证带鱼脊骨ACE抑制肽的体内作用效果和功能性质,对得到的带鱼脊骨ACE抑制肽进行了相关动物试验研究。利用超滤法得到分子量小于1000Da的ACE抑制肽,以此部分活性肽对原发性高血压大白鼠（SHR,Spontaneously Hypertensive Rat）进行一次性灌胃和长期灌胃试验,和小白鼠游泳试验。结果显示,带鱼脊骨ACE抑制肽对原发性高血压大白鼠（SHR）具有明显的降血压作用,对SHR心率没有不良影响。低剂量组（10.0 mg/kg）和高剂量组（50.0 mg/kg）一次性灌胃分别使SHR的血压下降8.8和20mmHg；长期灌胃使SHR的血压下降15和20mmHg。经口服带鱼脊骨生物活性肽,能够显著延长小白鼠的游泳时间,提高小白鼠的运动耐力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 生物活性肽概述
• 1.1 生物活性肽的来源
• 1.2 生物活性肽的特性
• 2 生物活性肽的制备
• 2.1 生物活性肽的制备方法
• 2.2 生物活性肽的制备原料
• 3 水产品生物活性肽研究现状
• 3.1 水产品降血压肽
• 3.2 水产品抗氧化肽
• 3.3 水产品抗菌肽
• 3.4 水产品抗肿瘤活性肽
• 3.5 其他水产品活性肽
• 4 立题背景及研究目的意义
• 4.1 立题背景及研究目的意义
• 4.2 研究内容和技术路线
• 第二章 制备ACEIP的水产蛋白原料筛选研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 水产蛋白原料的成分分析
• 2.2 两种蛋白酶酶解液的水解度比较
• 2.3 酶解液的ACE抑制活性比较
• 2.4 酶解液的抗氧化活性比较
• 2.5 带鱼脊骨氨基酸含量分析
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第三章 带鱼脊骨水解酶的筛选及酶解条件优化
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 酶的选择
• 2.2 酶解条件的单因素试验
• 2.3 酶解条件的优化
• 2.4 优化后的酶解过程跟踪分析
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第四章 带鱼脊骨复合酶解制备 ACEIP
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 复合酶解组合试验
• 2.2 复合酶解条件优化
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第五章 发酵法制备ACEIP菌种的筛选及发酵条件优化
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌种的选择
• 2.2 发酵培养基的筛选与优化
• 2.3 发酵过程动态分析
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第六章 5L罐生产ACEIP的发酵动力学研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 5L罐发酵过程
• 2.2 发酵动力学研究
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第七章 酶解带鱼脊骨ACEIP的分离纯化
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 超滤分级分离
• 2.2 小于5kDa的组分的凝胶层析分离
• 2.3 第10-5-4峰的反向高效液相色谱分离制备
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第八章 ACEIP的一级结构测定与分析
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 峰10-5-4的质谱分析结果
• 2.2 10-5-4组分的氨基酸序列分析
• 3 结论
• 第九章 带鱼脊骨ACEIP的动物试验研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料与仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 带鱼脊骨ACEIP对原发性高血压大白鼠（SHR）血压影响的研究
• 2.2 带鱼脊骨ACEIP的长期服用对SHR心率的影响
• 2.3 带鱼脊骨ACEIP的小鼠游泳试验
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.2 结论
• 第十章 主要结论及后续研究展望
• 1 本论文的主要研究结论
• 2 后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读博士期间的主要学术成果