青霉素G钠中致敏性杂质的分离

论文摘要

青霉素是临床上最易引发过敏反应的药物之一,但它本身并没有致敏性,引发过敏反应的最主要原因是青霉素制品中的大分子杂质,因此,去除致敏性大分子杂质对于降低青霉素过敏反应发生率具有重要意义。凝胶色谱法作为一种高效、易于操作的分离模式是分离青霉素中致敏性大分子杂质的有效手段。本文就凝胶色谱法分离的基础理论和青霉素G钠中致敏性杂质的分离去除工艺两方面展开了深入的研究。青霉素G钠的不稳定性将严重影响分离除杂的效果,为此研究了溶液种类、缓冲液浓度、pH值以及温度对青霉素G钠稳定性的影响。青霉素G钠在不同溶液中的稳定性顺序依次为:柠檬酸盐缓冲液＞醋酸盐缓冲液＞磷酸盐缓冲液＞碳酸钠溶液＞0.9%氯化钠溶液、5%葡萄糖溶液。在柠檬酸盐缓冲液中,缓冲液与青霉素G钠摩尔比大于0.75时有利于长时间保持稳定性。较低的温度和中性溶液有利于青霉素G钠溶液的稳定性。采用Sephadex G-25、G-10凝胶,对青霉素G钠中大分子杂质的分离条件进行了研究,考察了流动相种类、缓冲液浓度、温度对大分子杂质分离效果以及青霉素G钠色谱行为的影响,讨论了青霉素G钠与凝胶之间的相互作用机理。青霉素G钠在Sephadex凝胶上的色谱行为主要是体积排阻效应,但也存在溶质分子-凝胶之间吸附作用的次级效应。大分子杂质在G-10凝胶上的分离比在G-25凝胶上好,但青霉素G钠在G-10凝胶色谱上峰形分布较宽。在G-10凝胶上较高上样量的情况下,次级效应变得不明显,大部分青霉素G钠按照体积排阻效应被洗脱。研究了以Toyopearl HW-40F凝胶为分离介质对大分子杂质的分离。与G-10凝胶比较,HW-40F凝胶的柱效更高,对大分子杂质的分离效果更好,相同色谱条件下,青霉素G钠与HW-40F凝胶之间的吸附作用更明显。青霉素G钠在凝胶上的吸附作用主要由疏水相互作用引起,高离子强度、低溶液pH值有利于溶质分子疏水作用的增强,进而增大吸附作用。采用较低浓度的中性柠檬酸盐缓冲液做为流动相可以有效的分离青霉噻唑基类大分子杂质以及青霉噻唑酸,即使在上样量较大的情况下,分离效果也较好。采用前沿分析法研究了缓冲液种类和浓度、温度对青霉素G钠在HW-40F凝胶上吸附平衡行为的影响。在不同溶液中,青霉素G钠与HW-40F凝胶之间的吸附作用按照柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液的顺序依次降低:缓冲液浓度越高吸附量越大;温度越高吸附量越小。青霉素G钠在0.005 mol/L柠檬酸盐缓冲液中的吸附平衡数据可以用Freundlich方程拟合,拟合平均相对误差为1.881%;在0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.05 mol/L柠檬酸盐缓冲液中的吸附平衡数据可以用三参数方程Redlich-Peterson拟合,拟合吸附量的平均相对误差分别为3.573、2.646、2.118%。采用被动皮肤过敏试验,检验了HW-40F凝胶分离出的青霉素G钠分解液和商品青霉素G钠中各组分的致敏性。商品青霉素G钠中含有致敏性物质,其中,大分子杂质具有强致敏性,推测为青霉噻唑基类物质。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 青霉素概述
• 1.1.1 青霉素的结构
• 1.1.2 青霉素的作用机理与应用
• 1.1.3 青霉素的生产工艺
• 1.2 青霉素中的致敏性杂质
• 1.2.1 过敏反应机理
• 1.2.2 引起过敏反应的杂质
• 1.2.3 抗原决定簇
• 1.3 致敏性杂质的分离方法
• 1.3.1 透析法
• 1.3.2 离子交换色谱法
• 1.3.3 凝胶色谱法
• 1.4 免疫学方法检测杂质致敏性
• 1.4.1 沉淀反应
• 1.4.2 间接凝集反应
• 1.4.3 酶联免疫吸附法
• 1.4.4 放射免疫分析
• 1.4.5 动物被动皮肤过敏试验
• 1.5 本课题的意义
• 1.6 本课题研究的主要内容
• 2 青霉素G钠稳定性的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.4 HPLC分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验重现性
• 2.3.2 溶液种类对稳定性的影响
• 2.3.3 柠檬酸盐缓冲液浓度的影响
• 2.3.4 温度和pH的影响
• 2.4 本章小结
• 3 Sephadex凝胶分离大分子杂质
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验设备
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.4 Penamaldate法检测杂质
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 凝胶孔径对分离的影响
• 3.3.2 流动相的影响
• 3.3.3 温度的影响
• 3.3.4 大上样量下的大分子杂质分离效果
• 3.3.5 Penamaldate法检测杂质
• 3.4 本章小结
• 4 青霉素G钠在HW-40F凝胶上的吸附
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验的重现性
• 4.3.2 缓冲液的影响
• 4.3.3 温度的影响
• 4.3.4 吸附等温线的拟合
• 4.4 本章小结
• 5 Toyopearl HW-40F凝胶分离青霉素G钠中大分子杂质
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 流动相对分离的影响
• 5.3.2 pH值的影响
• 5.3.3 温度的影响
• 5.3.4 上样浓度的影响
• 5.3.5 Penamaldate法检测杂质
• 5.4 本章小结
• 6 大分子杂质致敏性的检验
• 6.1 实验材料与方法
• 6.1.1 材料与仪器
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 青霉素G钠分解液中各组分的分离
• 6.2.2 商品青霉素G钠中大分子杂质的分离
• 6.2.3 被动皮肤过敏试验
• 6.3 本章小结
• 7 结论
• 参考文献
• 作者简历及读博期间发表论文