论文题目: 水稻黄单胞Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RS105 LPS合成基因簇的功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理学
作者: 龙菊英
导师: 王金生
关键词: 水稻白叶枯病菌,水稻细菌性条斑病菌,脂多糖
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 水稻白叶枯病菌Xanthimonas oryzae pv．oryzae(Xoo)和水稻细菌性条斑病菌Xanthimonas oryzae pv．oryzicola(Xooc)是水稻上的两个致病变种。Xoo在亚热带国家成为一个重要的病害，在一定的栽培和生长季节发生Xoo可以导致50％以上的损失。Xooc只分布在热带地区，亚洲包括孟加拉，柬埔寨，中国的福建、广东和海南，发生严重的水稻也会造成叶片枯死和产量损失。同时两个模式种菌株也是研究植物病害的重要模式菌株，对两个病原细菌致病机理的了解有利于提高病害防治水平或改进防止策略。由于Xoo和Xooc限制修饰系统阻止细菌接受外源DNA，对Xoo和Xooc进行的反向遗传学研究在很大程度上受到了限制，在一定程度上限制了我们对两病原细菌的致病分子机制的理解。本文通过反向遗传学研究初步论证了Xooc菌株RS105 LPS与致病性的关系，从研究手法和致病机理两个方面为理解Xooc和Xoo做了一点铺垫。 1 突变体的获得和阳性克隆的筛选 通过化学诱变获得来自于Xooc菌株RS105和Xoo菌株PXO99丧失胞外多糖(Exopolysaccharide)和在水稻上致病力(Pathogenicity)的突变体，表示为EPS~-Path~-。从RS105中得到6个突变体，分别是M12、M13、M17、M19、M21、M23；从PXO99中得到三个突变体K7、K21、K23。以M12为诱饵从2200个RS105的基因组文库中钓取一个阳性克隆P35，同时以K7为诱饵从2000个PXO99基因组文库中得到一个阳性克隆A286。 P35阳性克隆以KpnI和EcoRI完全消化产生的亚克隆不能够恢复M12的功能，KpnI不完全消化得到一个包含两个KpnI片段的克隆PK23恢复了突变体的表型，进一步BamHI亚克隆PK23(12.7kb)也不能够产生有功能的片段，而EcoRI不完全消化产生的6.78kb的亚克隆P80恢复了M12的功能。序列测定表明6.78kb片段中可能包含7个基因，分别有一个KpnI、EcoRI切割在ORF1内，但是包含ORF1的BamHI亚克隆片段也不能够恢复M12的功能，说明恢复M12的功能需要ORF1和包含BamHI位点的另外一个基因ORF2同时参与。通过亚克隆PCR分析产生的ORF1-ORF3，ORF3-ORF2以及用PCR产生的ORF1和ORF2的克隆都不能恢复M12的功能，而
论文目录:
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文献综述
第一章 植物病原细菌及水稻黄单胞致病相关基因的研究进展
☆ Xanthimonas oryzae pv.oryzae无毒基因(avr gene)及其产物
☆ Hrp基因
☆ 鞭毛
☆ 生物膜
☆ 胞外多糖
☆ 胞外酶
☆ LPS在病害发生中的作用
第二章 脂多糖生物糖合成
☆ 脂多糖引言
☆ LPS结构
☆ 核苷糖前体合成途径和O抗原组装基因
☆ 糖基转移酶和O-单元形成
☆ O-抗原加工、转运(processing)基因
☆ O-抗原基因族的来源和维持
第三章 脂多糖的运输
☆ 引言
☆ 生物合成O-特异的多糖
△ 起始阶段
△ 延伸／转运／聚合
△ 连接反应
△ Und-PP的再循环
☆ LPS的细胞表面定位
☆ 未来研究工作的重点
研究报告
第一章 恢复M12(RS105)EPS~-Path~-表型的阳性克隆P35亚克隆分析
1 材料与方法
1.1 供试菌株与质粒
1.2 培养条件和抗生素
1.3 生长曲线和毒性实验
1.4 DNA操作和功能互补
1.5 LPS分析
1.6 DNA序列测定和分析
1.7 菌落表型观察和游动性测定
1.8 Southern杂交
2 结果与分析
2.1 化学突变体的获得
2.2 阳性克隆的筛选
2.3 亚克隆分析
2.4 来源于RS105，PX099的其他同类突变体的序列分析
2.5 突变体脂多糖的检测
3 讨论
第二章 恢复M12功能的阳性克隆P80内orfs的序列分析
1 材料与方法
1.1 研究序列的来源
1.2 同源序列搜索
1.3 蛋白生化参数的分析
1.4 蛋白保守顺序和结构的预测
2 序列分析与结果
2.1 P80包含基因簇与Xanthomonaslps合成基因簇的比较
2.2 7个LPS合成相关蛋白的分子量，等电点，G+C含量的计算和亚细胞定位
2.3 7个蛋白可能存在的修饰位点的预测
2.4 蛋白功能相关预测
3 讨论
3.1 Xooc LPS合成基因高度变异，基因簇通过水平转移(Hor izontal Gene Transfer)获得，具非典型的G+C含量
3.2 WxoeA，WxocB和WxocC三个基因产物功能以鼠李糖为底物
3.3 Wzt是ABC-转运系统的ATP-结合蛋白，WxocE和WxocD是甲基转移酶.WxocF是乙酰基转移酶
3.4 组成Xooc的LPS结构的糖基有甲基和乙酰基修饰
第三章 恢复M12功能的阳性克隆P80内orfs的突变分析
1 材料和方法
1.1 供试菌株，培养条件与质粒
1.2 用于产生wxocB、wxocD、wxocE和wzt基因突变体的同源序列的PCR引物
1.3 PCR产物的回收克隆,序列验证，质粒提取，DNA提取参见第1章
1.4 突变转化单元的构建
1.5 水稻黄单胞感受态细胞的制备
1.6 电转化和标记交换
1.7 Southern杂交见第一章
1.8 LPS的提取
1.9 细菌游动性的测定
1.10 透射电镜负染观察鞭毛
1.11 生物膜的定性观察
1.12 生长曲线和致病性测定
2 结果与分析
2.1 变体转化单元的构建
2.2 WxocA、wxocB、wxocD、wxocE、wzt基因突变体LPS电泳分析
2.3 菌落形态，生物膜形成，游动性及鞭毛等细胞学特性的检测
2.4 突变体在水稻上的繁殖能力及致病性测定
3 讨论
3.1 基因敲除:以CoIE1为复制原点的质粒pBCSK(-)和R6K复制原点的载体pKNG101适用于Xooc的基因敲除
3.2 P80序列中的基因参与LPS核心和O-抗原的合成
3.3 Xooc O-抗原与毒性的关系
3.4 LPS和EPS合成的相互关系，Wzt基因与EPS合成相关是该基因功能的一个新发现
3.5 突变体改变的多种细胞学结构和功能的表达与致病性的关系
参考文献
附录：水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)无毒基因avrXa3和同源基因aB2.9对PXO99寄生适应性分析
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致谢
发布时间: 2006-10-20
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