A1型短指（趾）症致病基因IHH的体外功能研究及精神分裂症关联分析

论文摘要

2001年,我们首次报道了IHH基因的杂合子突变导致了A1型短指（趾）症,患者表型为指节缩短或掌骨缩短,并可能伴有身高缺陷。IHH信号对软骨细胞的增殖和分化都起着关键的调控作用,对内源性骨化的发育也很重要。随后也有大量文献报道了IHH内的杂合子突变导致了该表型。然而到目前为止,关于这些突变是如何导致这些表型的分子机制还是一片空白。本课题中,我们用全长的IHHcDNA及纯化的N-IHH蛋白对三个突变（p.E95K, p.D100E and p.E131K）做了信号检测,第一次对这些突变导致的分子效应做了报道。IHH突变后并没有完全丧失功能,突变IHH蛋白在C3H10T1/2细胞中诱导的通路效应严重受损,表明这些突变可能影响了与受体PTC1之间直接或间接的结合关系。Wt N-IHH蛋白能诱导靶基因Ptc1和Gli1的表达水平显著上升,与体内经典的PTC/SMO/GLI通路途径一致。因此,本研究所提供的信息将有助于阐述这些突变在体内的作用机制。还运用基因芯片技术比较了C3H10T1/2细胞在受到Wt和突变蛋白诱导后基因的表达差异。3个新基因（Sostdc1,Penk1和Igfbp5）被证明的确是IHH信号的靶基因。通过凝胶迁移实验,Penk1和Igfbp5还被证明是GLI1转录因子的新靶基因。SOSTDC1是BMP蛋白的拮抗剂,已经有很多文献表明BMP信号与IHH信号共同协调参与了骨骼发育的调控。Penk1和Igfbp5在骨骼发育当中所起的作用还不明确。我们首次报道Igfbp5和Penk1在小鼠的指节发育中,具有类似于Gdf5的表达模式,都表达于将形成关节的部位,预示着这两个基因可能与关节发育相关,从而也进一步的将IHH信号与关节发育联系起来了。此外还对3个精神分裂症的候选基因（GRIA4,RGS4,GRID1）基于中国汉族人群进行了病例-对照关联分析。没有发现GRIA4以及RGS4内的多态性位点与精神分裂症相关的证据。对GRID1的研究中发现在北方样本组中,rs1902666,rs11591408以及rs999383与精神分裂症之间都存在显著性相关,P值分别为0.0062, 0.000018以及0.00045。

论文目录

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第一部分引言

第一章 A1 型短指（趾）症及其致病基因INDIAN HEDGEHOG （IHH ）

第一节 A1 型短指（趾）症简介

1.1.1 A1 型短指（趾）症（BDA1）的发现历程

1.1.2 A1 型短指（趾）家系分析

第二节 IHH基因的研究进展

1.2.1 Hedgehog基因家族

1.2.2 Hedgehog信号通路

1.2.3 PTC-SMO的关系

1.2.4 软骨与骨的形成

1.2.5 IHH与骨骼发育

第三节 A1 型短指（趾）症与IHH基因的关系

1.3.1 A1 型短指（趾）症的定位

1.3.2 A1 型短指（趾）症致病基因及其突变的发现

第四节 C3H10T1/2 干细胞系的特点

第五节脊椎动物骨骼发育模式

1.5.1 脊椎动物肢体发育模式

1.5.2 脊椎动物指/趾发育模式

第二章精神分裂症遗传学综述

第一节精神分裂症的概念

2.1.1 精神分裂症的概念及其病因学

2.1.2 精神分裂症的临床表现

2.1.3 精神分裂症的主要类型

2.1.4 精神分裂症的诊断标准

2.1.5 精神障碍的疾病负担

第二节遗传病学研究方法

2.2.1 连锁分析（linkage analysis）

2.2.2 关联分析（association analysis）

2.2.2.1 关联（连锁不平衡）的定义

2.2.2.2 等位基因关联产生的机制

2.2.2.3 病例-对照研究与人群层化

2.2.3 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）

2.2.3.1 SNPs的概念

2.2.3.2 SNPs的研究意义

第二部分实验

第一章实验手段及其原理、方法

1.1 PCR, RT-PCR, Real-Time quantitative PCR

1.2 载体构建与转化

1.3 基因的原核表达与纯化

1.4 基因芯片与基因表达分析

1.5 基因的真核表达与鉴定

1.6 细胞培养与稳定克隆的构建

1.7 凝胶迁移实验（EMSA）

1.8 整体原位杂交实验（Whole Mount In situ Hybridyzation）

第二章 A1 型短指（趾）IHH基因的体外功能研究

第一节研究目的及策略

第二节实验设计与方法

2.2.1 实验设计

2.2.2 实验方法

第三节实验结果与分析

2.3.1 在C3H10T1/2 细胞中寻找最佳IHH信号通路效应分析条件

2.3.2 导致A1 型短指（趾）症的突变IHH的Hedgehog信号效应严重受损

2.3.3 在Wt和突变蛋白诱导后,具有不同表达水平的新基因的发现

2.3.4 Penk1 和Igfbp5 是依赖于GLI1 转录因子的IHH信号通路的直接靶基因

2.3.5 Penk1 和Igfbp5 在关节将要形成的部位具有特异性表达

第四节讨论

2.4.1 IHH基因突变导致了hedgehog信号效应的损伤

2.4.2 IHH突变也影响了Sostdc1,Penk1 和Igfbp5 的表达

2.4.3 受IHH调控的新基因与指节发育的关系

第五节本课题的后续研究以及展望

第三章精神分裂症候选基因的关联分析

第一节实验方法和统计方法

3.1 分子生物学实验方法

3.1.1 DNA提取

3.1.2 基因分型

3.2 数据统计分析

3.2.1 样品资料和SNPs基因分型

3.2.2 Hardy-Weinberg平衡分析

3.2.3 基因型和Allele型频率分析

3.2.4 Odds ratio（OR）及其95%的可置信区间

3.2.5 连锁不平衡（LD）的计算

3.2.6 单倍型（Haplotype）分析

3.2.7 样本量的统计学力度分析

3.2.8 Bonferroni校正

3.2.9 整合的统计分析网页

第二节 GRIA4 与精神分裂症的关联分析

3.2.1 精神分裂症的GRIA4 基因假说

3.2.2 实验样品

3.2.3 分型结果与数据统计

3.2.4 讨论

第三节 RG54 与精神分裂症的关联分析

3.3.1 精神分裂症的RG54 基因假说

3.3.2 实验样品

3.3.3 分型结果与数据统计

3.3.4 讨论

第四节 GRID1 与精神分裂症的关联分析

3.4.1 精神分裂症的GRID1 基因假说

3.4.2 实验样品

3.4.3 分型结果与数据统计

3.4.4 讨论

第五节关联分析后续研究展望

第三部分参考文献

第一章 A1 型短指（趾）症致病基因IHH的体外功能研究

第二章精神分裂症候选基因的关联分析

第四部分硕博期间已发表和已成文的论文目录

第五部分致谢

第六部分部分论文英文版摘要

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